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[求救] SDS PAGE完全沒有band 除了marker

看板Biotech (生命科學)作者 (微笑使人更美)時間15年前 (2011/02/27 16:39), 編輯推噓4(4推 0噓 23→)
留言27則, 6人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 以方便板友幫您追蹤問題 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- 我最近在純化一蛋白質 transformation--> IPTG induction--> lysis cell(E.Coli) 將lysis後分離出sup 及 pellet 並拿來跑膠 但是最後我跑SDS-PAGE 出來 並用cromassie blue染膠 destain後 卻是空白的 除了marker以外 我做了2-3次了 我不懂 怎麼會連pellet都沒有任何protein 有人知道為什麼嗎? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.25.186
推
02/27 19:50, , 1F
你講的空白是說看不到你要的東西還是整條都空白沒有任何
02/27 19:50, 1F
→
02/27 19:50, , 2F
的東西?
02/27 19:50, 2F
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02/27 20:59, , 3F
整條都沒有東西 連pellet 都沒有真的很奇怪~
02/27 20:59, 3F
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02/27 21:01, , 4F
我也有做positive control但是連positive control也是這樣
02/27 21:01, 4F
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02/28 00:16, , 5F
pellet量太少? 或是太多沒煮開? 或是reducing dye壞了?
02/28 00:16, 5F
推
02/28 01:15, , 6F
SDS PAGE中SDS比例? protein sample treatment?
02/28 01:15, 6F
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02/28 10:35, , 7F
送張圖上來比較好讓李組長了解案情唷...
02/28 10:35, 7F
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02/28 14:47, , 8F
Competent cell有無用錯?
02/28 14:47, 8F
推
02/28 18:17, , 9F
因為marker有染到 所以最有可能是樣品處理的問題
02/28 18:17, 9F
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02/28 18:19, , 10F
樣品定量了沒 你加多少樣品下去跑?
02/28 18:19, 10F
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03/01 15:50, , 11F
PO 圖喔 要怎麼PO?
03/01 15:50, 11F
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03/01 15:51, , 12F
我沒有定量耶 因為我只是想看有沒有我想要的東西在裡面
03/01 15:51, 12F
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03/01 15:52, , 13F
我養了15 ml的terrific broth~我都load 10ul跑膠
03/01 15:52, 13F
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03/01 15:53, , 14F
dye應該沒問題 因為實驗室裡有另一個學弟也都用同一罐dye
03/01 15:53, 14F
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03/01 15:54, , 15F
應該也沒問題才對 太多沒煮開會有很大影響嗎?
03/01 15:54, 15F
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03/01 15:58, , 16F
competent cell我是用rosetta
03/01 15:58, 16F
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03/01 16:04, , 17F
lysis cell後就加sample buffer(final 1X) boil92度C 20分
03/01 16:04, 17F
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03/01 16:05, , 18F
然後mix well就load 膠啦
03/01 16:05, 18F
推
03/01 23:42, , 19F
你有別的東西可以拿來確定電泳系統有沒有問題嗎?
03/01 23:42, 19F
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03/01 23:43, , 20F
像是之前成功跑的樣品 或是別人的樣品有成功過的
03/01 23:43, 20F
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03/01 23:45, , 21F
如果你們家有別人 建議他要跑時你借幾個well一起跑
03/01 23:45, 21F
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03/01 23:46, , 22F
不過會一片空白 我還是覺得樣品處理有問題 尤其是定量
03/01 23:46, 22F
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03/06 17:28, , 23F
結果我又重新做一次 養細胞的方式 用terrific broth warm
03/06 17:28, 23F
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03/06 17:29, , 24F
up 在進行induction 我用了原本的lysis cell的protocol和
03/06 17:29, 24F
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03/06 17:30, , 25F
另一種最初的protocol denature也減短至10min
03/06 17:30, 25F
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03/06 17:32, , 26F
load 20ulrun SDS PAGE發現這次跑出來就每個lane都有東西
03/06 17:32, 26F
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03/06 17:33, , 27F
所以之前pellet會完全空白 是因為denature太過嚴重嗎
03/06 17:33, 27F
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