[求救] Ligation 一直無法成功

看板Biotech (生命科學)作者akongapple (阿康)時間15年前 (2011/04/27 16:06)推噓13(13推 0噓 23→)

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關於ligation的相關問題，版上有許多資訊，有先爬了一下版上的相關資料，可是我還是想不出我的問題出在哪裡，所以想PO上來請教一下大家，拜託大家了，以下是我的實驗步驟： Insert DNA：以pEGFP-C1為template，用自行設計的primers進行PCR， primers上有設計好的restriction enzyme cutting sites，在cutting sites以外各有預留了6 bp以上的sequence，以避免restriction enzyme無法辨認進行cutting， PCR出來的長度共814 bp，因為我想利用一段PCR sequence做出兩種insert DNA，所以PCR sequence包含有EGFP gene和兩個以上的restriction enzyme cutting sites，也就是類似MCS的sequence。經由EcoRI和HindIII切完後為793 bp為第一個insert DNA，而經由KpnI和HindIII切完後為771 bp為第二個insert DNA，確認方式為跑agarose gel，主要是用2.5% agarose gel 進行確認，可以發現經由restriction enzyme反應後的band相較於PCR的band會位於較低的位置，而切膠純化主要是用1.4% agarose gel，純化後的濃度大概在22 ng/uL左右，另外純化後的insert DNA若單獨進行ligation後跑膠可以發現有形成dimer的band，大約在1500 bp稍微上面一點的位置，因此應該可以證明insert DNA有確實地被 restriction enzyme進行cutting。 Vector DNA：主要是用實驗室現有的兩個plasmids，plasmids上面帶有ampicillin resistent gene，而第一個plasmid可以被EcoRI和HindIII進行cutting，切完後的片段為4512、725、509和47 bp，用 1.4% agarose gel跑膠後將4512 bp的band進行切膠純化作為vector DNA；第二個plasmid可以被KpnI和HindIII進行cutting，切完後的片段為4606和1265bp，一樣用1.4% agarose gel跑膠後將4606 bp的band進行切膠純化後作為vector DNA，兩者在進行切膠純化前均有用CIP作處理，純化後的濃度均約在50 ng/uL左右，另外純化後的vector DNA有單獨進行ligation後跑膠，發現並無其他的band，只有在6557到4361 bp的marker間有single band。 Ligation reaction；先設定vector DNA為100 ng，依據molar ratio insert : vector = 1:1或3:1加入insert DNA，T4 ligase和buffer各加入 1 uL，反應體積為10 uL， Total DNA amount約在100~150 ng左右，反應條件為4度C over night。 Transformation：取2 uL的ligation mixture加入50 uL的competent cells，冰上30 min ，42度C 40秒，冰上2 min，加入SOC medium 1 hr，取適量塗在含有ampicillin的LB agar plate上，positive control為未進行digestion的plasmids，negative control 為digestion後的plasmid，結果positive control長出來的菌落超過50個，但是negative control和ligation sample都沒有長出任何菌落。以上條件已經重複約10次，做了快三個月了，均無法長出任何colony，請教大家這步驟是否有我未注意到的地方呢？拜託大家了。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.121.97

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FENOR

04/27 16:51, , 1^F

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musicman

04/27 17:19, , 2^F

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musicman

04/27 17:21, , 3^F

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