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[求救] 蛋白質濃度測不準...pipetman操作問題?

看板Biotech (生命科學)作者 (樂在學習)時間14年前 (2011/07/30 03:54), 編輯推噓11(11推 0噓 22→)
留言33則, 12人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
大家好，第一次在這裡發文請多指教> < 我是今年的碩一新生，最近在實驗室裡學習跑western 再跑之前有先去測蛋白質濃度，但測出來發現 我的standard做得非常不準...我的R值只有0.95.....(學長說要0.99才夠準) 但我在操作的過程中都有學長在旁檢視、提點，所以應該是沒有加錯東西 再討論過後推測可能是我的pipetman操作不當，量取不精準所致... 固定protein濃度後去跑膠，結果今天壓片出來，我的兩條band竟然差了快兩倍!!! (一樣濃度應該要一樣粗啊> <)所以是我真的加得很不準= =a 可是我並非第一次接觸pipetman啊~大學時期曾待過實驗室一年 (不過以前實驗並沒有要求非常精準，所以可能問題一直存在只是我現在才發現= =) 也知道pipetman有兩段，第一段吸、第二段放... 我有先稍微爬了一下文，去看pipetman的操作 再由低轉到高時也會轉超過才轉至我要的值 跟學長姐討論後，他們說因素太多了，有可能是我吸放的速度太快 或是讓protein殘留在tip上過多...等，不過因為他們都沒有這樣的狀況 所以也不知道究竟問題在哪...(只有我有這樣的問題...我的手在搞甚麼啊QQ...) 目前是叫我就繼續多練習找找手感 不過我希望能降低失敗次數不要浪費前輩們的時間及老師的金錢> < 所以想請教各位(有人遇過這情形嗎T^T)在加東西的時候該怎麼加比較準確? 是先加在管壁上然後再離心? 還是要稍微碰到液面加? 亦或是要懸空加?? 然後吸跟放的速度都是要慢一點???(不過我有時慢放又會有一點點液體倒吸回tip上ˊˋ) 我的問題好笨喔ˊˋ但還是懇請大家提供一點心得或意見... 感激不盡 謝謝: ) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 220.134.145.35
推
07/30 12:08, , 1F
吸放都要慢 特別是較黏溶液
07/30 12:08, 1F
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07/30 12:08, , 2F
放的時候tip在液面下按到底 抽出
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07/30 12:09, , 3F
來再放開就可避免倒吸
07/30 12:09, 3F
推
07/30 13:08, , 4F
上次有sales建議 要先吸放個3-5次 讓tip管壁上先有液體
07/30 13:08, 4F
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07/30 13:10, , 5F
之後排掉重吸才準 因為管壁上很多細小不平的痕跡會卡液體
07/30 13:10, 5F
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07/30 13:12, , 6F
另外個人比較偏向加到液體裡 加管壁上感覺就會有部分殘留
07/30 13:12, 6F
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07/30 15:28, , 7F
用水多練習找手感 可以順便稱重觀察
07/30 15:28, 7F
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07/30 21:00, , 8F
謝謝大家~我會試試，下星期會再測一次濃度，到時就
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07/30 21:01, , 9F
可以知道成果了@@真緊張~
07/30 21:01, 9F
推
07/30 22:19, , 10F
我是在液面上吐出一點小水珠讓它跟液面連接緩慢吐完液體
07/30 22:19, 10F
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07/30 22:21, , 11F
不要讓tip與液體接觸 我也是95被操到99的 加油喔!
07/30 22:21, 11F
推
07/30 22:26, , 12F
個人覺得吸放3-5次很關鍵 話說以前lab的標準是0.995(遠目
07/30 22:26, 12F
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07/30 22:27, , 13F
不要太緊張 做實驗前先"冥想"每一個步驟 忌手忙腳亂XD
07/30 22:27, 13F
推
07/31 00:31, , 14F
是用BioRad protein assay dye?用分光光度計測還是96well盤?
07/31 00:31, 14F
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07/31 00:33, , 15F
劇我所知，這個dye很會卡顏色～分光測的話，記得要先用酒精
07/31 00:33, 15F
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07/31 00:35, , 16F
洗再水洗～然後取樣時，要吸排幾次再取重複性會較高
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07/31 00:36, , 17F
還有有些溶液不好取，要慢慢吸才不會取不夠喔
07/31 00:36, 17F
推
07/31 14:41, , 18F
液面取 液面放!
07/31 14:41, 18F
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07/31 18:48, , 19F
to yaliu:沒錯!是BioRad protein assay dye!!!96孔盤
07/31 18:48, 19F
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07/31 18:49, , 20F
嗚哇0.995的目標似乎離我好遠= =我會加油的!謝謝各位
07/31 18:49, 20F
推
07/31 19:13, , 21F
pipetman沒定期校正?
07/31 19:13, 21F
推
08/01 00:30, , 22F
沒校正也應該不會每次吸放都差很多 除非氣密有損壞
08/01 00:30, 22F
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08/01 19:01, , 23F
是用dye呈色定量的話 還會有每個well反應時間不一樣的問題
08/01 19:01, 23F
推
08/02 01:40, , 24F
你的0.995會不會是到後來可能顏色太深所以偏掉？
08/02 01:40, 24F
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08/02 01:41, , 25F
另外你同個樣品間的重複性如何？
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推
08/02 09:11, , 26F
96well測之前有沒有輕拍plate使其搖勻?有沒有去泡泡!?
08/02 09:11, 26F
推
08/07 21:42, , 27F
我們老闆是要求我們進實驗室第一個月要練PIPET 吸水在微量
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08/07 21:43, , 28F
天平上操作 接下來是練吸光值 R值很穩定都是0.99才可以做
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08/07 21:43, , 29F
其他實驗 雖然一開始很苦 但是沒有這樣練技術不會好
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08/09 00:07, , 30F
在微量天秤沒問題...我想我可能是對那種黏滯性液體有
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08/09 00:13, , 31F
障礙吧= =上次又重做時，我的STANDARD還是很不準= =
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08/09 00:14, , 32F
但樣品重複還OK，所以我想可能是我加BSA或BIO-RAD那
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08/09 00:16, , 33F
有甚麼問題吧...加DYE下去不要PIPETING會比較好嗎?
08/09 00:16, 33F
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