Re: [求救] His-tag protein 純化 無法binding
※ 引述《diffa2 (Zero)》之銘言：
: 目前遇到與protein 純化的問題，我使用His-tag / Ni-NTA來純化，在induction
: 後protein有明顯的表現量，經破菌後也在supernatant中，但在之後的binding上，
: protein卻無法binding，大部分都在flow through中，之後的binding buffer也有
: 少量的protein沖出，elutein 有非常微弱的band
: 純化後的protein需保持其功能，不希望以Urea來denature再renature，希望各位可以提
: 供
: 一些經驗與資訊
: 所使用的是Rosetta菌株，用LB medium total 2L(500ml 分四瓶)以1:100放大1.5hr後
: 0.1 mM IPTG induce 3~4小時，之後4度C離心，
: 以下是我的純化方式 (用針筒自己packing)
: beads 5ml (reuse) 有經strip或是regeneration (兩種都無法bind)
: 15 ml binding buffer (5 mM imidazole)
: 25 ml 0.1 M NiSO4
: 15 ml binding buffer
: 10 ml sample (in binding buffer)
: 25 ml binding buffer
: 25 ml wash buffer (60 mM imidazole) wash 3 次
: 13 ml elution buffer (400 mM imidazole )
: 每個過後的buffer都取32ul跑膠，用coomassie bleue染色flow throug和supernatant量
: 差不多，之後的binding buffer也有點，最後的Elution中有非常非常微弱的band...
: 希望各位可以提供幫助 謝謝><"
有幾種建議：
1) 增加6xHis為10xHis 這個方法在一些paper上有討論過
2) 提高binding buffer的鹽濃度（如 加1~1.5M NaCl）。這個方法對DNA或RNA
binding protein特別有效。
3) 先用Ammonium sulfate梯度 找到沈澱目標蛋白濃度 再回溶做binding
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.32.34.31
討論串 (同標題文章)
本文引述了以下文章的的內容：
完整討論串 (本文為第 3 之 3 篇)：
Biotech 近期熱門文章
PTT職涯區 即時熱門文章
27
52
11
45