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[求救] PCR無法放大片段

看板Biotech (生命科學)作者 (soso)時間13年前 (2013/03/21 22:06), 編輯推噓4(4推 0噓 11→)
留言15則, 7人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
手上有一對primer 如果是用Plasmid當template的話 這對primer是可以使用 但如果把plasmid放大的產物經由Gel-extract後 拿來再次放大 卻無法有產物!!!而只有Smear..... 請問有什麼方法可以解決嗎?? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 134.76.0.211
推
03/21 22:29, , 1F
template放多少啊...會不會濃度過高
03/21 22:29, 1F
→
03/21 22:52, , 2F
GelEx 是否有超過一條的 band? PCR 的詳細條件？
03/21 22:52, 2F
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03/21 22:52, , 3F
還有你用什麼溶液來回溶 GelEx 的 DNA？
03/21 22:52, 3F
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03/21 23:55, , 4F
濃度太高是會p不出來的，大概5-10ng 就行了
03/21 23:55, 4F
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03/22 06:26, , 5F
X我是用水回溶的！至於pcr條件沒有變，只有template不同！
03/22 06:26, 5F
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03/22 06:27, , 6F
產物只有single band!其實其他對primer都沒問題！
03/22 06:27, 6F
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03/22 06:29, , 7F
我放50ng!!我會向下修！但我plasmid用200ng也有阿！Orz
03/22 06:29, 7F
推
03/22 11:31, , 8F
都太高了吧...plasmid用<1ng都沒問題, 用PCR product當
03/22 11:31, 8F
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03/22 11:31, , 9F
template得要更低,
03/22 11:31, 9F
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03/22 16:13, , 10F
用nested-PCR試試看，有時PCR產物本身兩端primer黏合的部
03/22 16:13, 10F
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03/22 16:14, , 11F
份會放大不完全，用它們當templates可能就會產生smear不
03/22 16:14, 11F
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03/22 16:14, , 12F
盡理想的結果。
03/22 16:14, 12F
推
03/23 14:43, , 13F
純化過的plasmid 10~100pg就夠了
03/23 14:43, 13F
推
03/26 13:58, , 14F
P過的產物最好不要用原來的primer重新P喔 最好用nested-PCR
03/26 13:58, 14F
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03/26 13:59, , 15F
這樣polymerase在template上才有立足點
03/26 13:59, 15F
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