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[求救] transform

看板Biotech (生命科學)作者 (pig)時間11年前 (2013/04/14 21:02), 編輯推噓17(17推 0噓 89→)
留言106則, 10人參與, 最新討論串1/1
請問一下版上的各位先進 我們家的competent cell是跟廠商買的不是自己做的 我在做的時候會習慣將一管100ul competent cell分成五管來進行 也就是這五管分別加入不同molar ratio的ligation product 但都沒有長出任何的colony 在想是不是要改一成一管100 ul competent cell一個molar ratio 我想請問competent cell的量是否會有影響呢？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 124.11.132.89
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04/14 21:17, , 1F
當然有，但是跟ligation product也有關
04/14 21:17, 1F
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04/14 21:26, , 2F
ligation的部份有跟老師討論研究過了~應該是沒有問題
04/14 21:26, 2F
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.132.89 (04/14 21:27)
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04/14 22:22, , 3F
我以為分很多管是常態,通常這樣做不出來會是其他問題
04/14 22:22, 3F
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04/14 23:01, , 4F
我也以為是常態XD
04/14 23:01, 4F
說一下目前的情況 insert(900bp)成功接進yT&A當中 用兩個限制酶(Xba I，Cla I)將insert切下再接入另外一個vector(pBK-CMV-Gal4)中 vector的部份是先以Cla I作用兩小時，跑膠確認有沒有切乾淨 再以Xba I作用兩小時，切膠純化 進行ligation，molar ratio 1:2 ~ 6 4度C overnight，70度C中止反應(ligation product有跑膠，出現DNA ladder 老師說這樣是有發生ligation) 進行transform 用HIT competent cell(100uL/tube) 以tap water解凍至1/3融解 分裝成五管，每管20uL 取小於等於competent cell體積10%的ligation product(2uL)加入competent cell vortex 1s 冰上反應5分鐘 塗盤，37度C培養overnight 隔天就什麼也沒看到...而且我還有做一管是完整的plasmid去進行transform 結果也什麼都沒長... ※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.136.149 (04/14 23:25)
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04/14 23:42, , 5F
pBK-CMV是Kan吧,HIT,YB這些快速transform的遇到Kan最好能找
04/14 23:42, 5F
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04/14 23:43, , 6F
照以前revovey放置30min比較好,而且Kan也盡量25ug/ml以下
04/14 23:43, 6F
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04/14 23:52, , 7F
ladder的位置正確嗎 gel底部能否看到insert
04/14 23:52, 7F
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04/14 23:56, , 8F
另外冰上反應有敲嗎，建議反應完做一下recovery
04/14 23:56, 8F
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04/15 00:00, , 9F
@blence我Kan是用25ug/mL，謝謝建議
04/15 00:00, 9F
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04/15 00:01, , 10F
@joey0715 少打一個XD，冰上反應前有vortex 1s
04/15 00:01, 10F
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.136.149 (04/15 00:01)
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04/15 00:02, , 11F
我們養DH5a會有42度45秒的步驟再冰上1分..不會直接塗盤耶@@
04/15 00:02, 11F
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04/15 00:04, , 12F
我是都照廠商給的protocol
04/15 00:04, 12F
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04/15 00:05, , 13F
ladder的位置有沒有正確我不知道@@，接起來也不是環狀
04/15 00:05, 13F
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04/15 00:05, , 14F
所以我不知道怎麼看...但insert是看不到的
04/15 00:05, 14F
推
04/15 08:40, , 15F
不然試試看培養液 recovery 1hr 後再塗盤勒
04/15 08:40, 15F
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04/15 13:19, , 16F
想請問一下recovery的時候要不要shaking
04/15 13:19, 16F
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04/15 13:24, , 17F
circular的話會在total大小上下共有3個band
04/15 13:24, 17F
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04/15 13:29, , 18F
有check marker是否跑掉嗎，recovery大約1ml就夠塗前濃縮
04/15 13:29, 18F
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04/16 09:39, , 19F
在那附近有好多band...
04/16 09:39, 19F
這次多加了個recovery 30min的步驟 control組(完整的vector)有長出來了 長滿滿的 可是實驗組卻還是一顆都沒有長... 好難過... ※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.120 (04/16 09:41)
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04/16 10:34, , 20F
42度 heat shock?
04/16 10:34, 20F
廠商protocol上沒說要heat shock 還是我要多加這一步？
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04/16 10:37, , 21F
膠圖拿出來大家討論吧
04/16 10:37, 21F
http://photo.xuite.net/a14743535/6260888/1.jpg
以上是我的膠圖 vector是4700bp insert約850bp ※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/16 11:24)
推
04/16 11:24, , 22F
多做個heat shock試試看?
04/16 11:24, 22F
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04/16 11:29, , 23F
vector only切完有那麼多條，是原本有接東西在裡面?
04/16 11:29, 23F
我的vector上面原本就已經有個Gal 4接上去 vector only是在做ligation的時候DNA只加經過double RE digest的vector不含insert 然後這個vector是用切膠純化下來的 ※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/16 11:47)
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04/16 13:24, , 24F
沒碰過會ladder的，也沒碰過接不是環狀的@@
04/16 13:24, 24F
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04/16 13:30, , 25F
怎麼確定有接上的呢？
04/16 13:30, 25F
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04/16 13:56, , 26F
為什麼vector only經過XbaI跟ClaI切過會有這麼多band？是切
04/16 13:56, 26F
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04/16 13:57, , 27F
膠完純化後才跑膠嗎？
04/16 13:57, 27F
我也不知道為什麼會有這麼多band@@ 我是將vector先以Cla I切再以Xba I切之後跑膠純化 再將純化出來的取一點出來 加入buffer A 1 buffer B 1 vector 3 ddH20 4 ligase 1 --------------------- total 10uL 再跑膠後就變那個樣子了
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04/16 14:00, , 28F
你們老師說的ligation product有出現ladder才算lgation發生
04/16 14:00, 28F
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04/16 14:03, , 29F
這句話問題很大,一般transform會成功的用量,跑膠根本看不到
04/16 14:03, 29F
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04/16 14:06, , 30F
他可能指是製造特殊nt的plasmid從linear接成ccc的評估方式
04/16 14:06, 30F
※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/16 14:27)
還有 45 則推文
還有 6 段內文
怎麼說？ ※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.139.25 (04/17 01:41)
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04/17 09:22, , 76F
你手上應該有pBK-CMV-GAL4的map吧!!先看一下ClaI切在哪
04/17 09:22, 76F
我只有單純的pBK-CMV的map... ClaI在pBK-CMV上確實有兩個切位是在1036bp跟4028bp的位子上 如果兩個切位都被切到 那應該會有約3000bp跟約1500bp的片段 可是在我只單用ClaI 切的時候 並沒有看到這兩個片段 我也有去查過Gal4的切位 上面都沒有XbaI或ClaI的切位 ※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/17 09:53)
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04/17 12:01, , 77F
那就對啦!!這就是現在怪異的地方，先確定你拿到的vector
04/17 12:01, 77F
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04/17 12:01, , 78F
是不是對的囉!!
04/17 12:01, 78F
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04/17 12:41, , 79F
是送定序?
04/17 12:41, 79F
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04/17 13:14, , 80F
送訂序...新手要先學習MCS沒寫的就不該用,除非你很熟
04/17 13:14, 80F
確實是沒很熟@@ 只是實驗是由學姐設計的 後來才交給我做的...所以有些部份也不是非常清楚
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04/17 13:16, , 81F
而且雙切後的應該4.7k,前面就提了你也沒檢查過這個結果
04/17 13:16, 81F
檢查這個結果? 這裡我想請問一下該怎麼檢查 因為單切在上面我有再附一張膠圖了 而雙切我是沒有另外再拍下來 大小也是在那個位置附近
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04/17 13:19, , 82F
另外,你的圖若使用快速dye也應該要瞭解有何缺點,問題太多了
04/17 13:19, 82F
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04/17 13:23, , 83F
瞭解Gal4在pBK的MCS位置,換新的RE,才是解決方法
04/17 13:23, 83F
這個我有了解過了 Gal4是接在原本BamHI跟SpeI的地方 沒有影響到我要用的兩個酵素的位置 ※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/17 13:43)
推
04/17 13:42, , 84F
ligation PCR 3個小時就可以知道結果, 1ul的ligation
04/17 13:42, 84F
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04/17 13:43, , 85F
product對PCR效率並沒太大影響.
04/17 13:43, 85F
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04/17 13:44, , 86F
如此一來你可以知道到底有沒有ligation成功
04/17 13:44, 86F
※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/17 13:46)
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04/17 13:44, , 87F
如果有,那就是後面transform的問題
04/17 13:44, 87F
推
04/17 14:09, , 88F
ClaI這個酵素會受到dam dcm影響,DNA被甲基化就切不動.
04/17 14:09, 88F
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04/17 14:10, , 89F
也許位於4028bp的ClaI site是因為DNA被甲基化而切不動
04/17 14:10, 89F
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04/17 14:11, , 90F
根據原PO的講法, XbaI or ClaI 單切/雙切都是4.7kbp band
04/17 14:11, 90F
因為兩個所切下來的片段才20~30bp而已~膠上看不太出來這微小的差異吧 ※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/17 14:18)
推
04/17 14:24, , 91F
ClaI(1036bp) 和XbaI切下來的小片段當然看不到.
04/17 14:24, 91F
→
04/17 14:26, , 92F
重點是ClaI(4028bp)到底是不見了還是甲基化了,因為切不動
04/17 14:26, 92F
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04/17 14:26, , 93F
所以大家才會覺得vector本身可能就有問題
04/17 14:26, 93F
我不知道有什麼方法可以檢查... 定序的話 也沒有那個primer可以定到那個區域... ※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/17 14:35)
推
04/17 14:45, , 94F
其實定序用的primer自己設計一個就可以囉
04/17 14:45, 94F
→
04/17 14:47, , 95F
沒軟體可用就土法煉鋼的數個20mer，Tm大約算一下就可以了
04/17 14:47, 95F
推
04/17 14:53, , 96F
用NcoI切看看,應該會 700bp, 1.9k, 2.1k
04/17 14:53, 96F
推
04/17 14:54, , 97F
不然就是找個dam/dcm-的competent cell retransform
04/17 14:54, 97F
→
04/17 14:55, , 98F
vector，抽出來再切切看囉!!
04/17 14:55, 98F
→
04/17 14:58, , 99F
原PO可以用vector NTI做一個自己的map
04/17 14:58, 99F
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04/17 14:59, , 100F
用addgene上的pBK-CMV 序列加上你們自己塞進去的Gal4
04/17 14:59, 100F
→
04/17 15:00, , 101F
用甚麼酵素切會跑出多大size的band就會一目瞭然
04/17 15:00, 101F
推
04/18 13:25, , 102F
推樓上，沒有primer就自己設計一個，一邊在vector
04/18 13:25, 102F
→
04/18 13:25, , 103F
一邊在你的基因上，今天訂，明天你就可以PCR囉 :)
04/18 13:25, 103F
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04/18 13:27, , 104F
話說，如果你最後成功了，記得把問題解決方式在整理上來:)
04/18 13:27, 104F
最近又試了幾次 連ligase都換成新 現在變成連control(uncut vector)都長不出來... 之前明明就有長出來的說 ※ 編輯: a14743535 來自: 27.245.228.127 (05/01 10:11)
推
05/02 14:21, , 105F
你可以把最近做的流程再打一篇問會比較好喔!!
05/02 14:21, 105F
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05/02 14:22, , 106F
這篇已經被堆到後面了，比較難被發現
05/02 14:22, 106F
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