[求救] 免疫沉澱新手問題(看ubiquitinated 蛋白)
板上各位先進好
本人最近在做免疫沉澱(IP)，目的是想看細胞內某蛋白ubiquitination的情形，
但本人是免疫沉澱新手，有許多細節還不太清楚，目前操作步驟如下述，
希望板上先進可以幫忙看看有沒有須改進的地方，最後面還有一些雞毛蒜皮的問題，
也希望能為小弟一併解答.....
(小弟表達能力不太好，若看不太懂請見諒...)
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Cell Lysate Preparation
RIPA (for cell lysis)
150 mM NaCl 50 mM Tris-Cl (pH 7.4)
1 mM EDTA 1.0% Nonidet P-40 (NP-40)
0.1% SDS 0.5% Sodium deoxycholate
使用前加Protease Inhibitor
1. 以冰PBS wash dish 2次，傾斜plate將殘餘PBS移除乾淨，
每10cm dish加 100 uL cold RIPA，冰上刮下到離心管，
冰上靜置30分鐘，每5分鐘強力vortex 10秒。
2. 12,000 rpm離心15分鐘，4度C。
3. 取上清到新離心管置於冰上，測蛋白濃度，當日接著做IP。
Immunoprecipitation
1. 磁珠去除保存液，以 PBS+0.1% Tween 20 (後稱PBST) 洗2次，
然後加入PBST待用(體積同取出磁珠液時的體積)。
2. 取 100-200 ug Lysate (體積 100 uL以內)，以RIPA補到 100 uL。
3. 加入 50 uL 磁珠，再補 100 uL PBST，至此IP反應總體積 250 uL。
4. 加入 1 ug Capture Ab，以parafilm封口，4度C下翻轉反應overnight。
5. 去除上清留下磁珠，以PBST wash 3次。
Elution
磁珠加入 40 uL 1X Loading Buffer，95度C下震盪10分鐘後，
插冰上稍微冷卻後，立即將液體移到新管(約剩 30 uL 多一點點)。
Western Blot
每個sample load 30 uL
(因為此部分比較沒有疑慮，所以就不多加敘述了)
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另外，還有下面的問題想請教各位：
1. 如果要排除protein-protein interaction，以RIPA收下lysate後，
是否需要先95度C煮過再做IP?
目前做的是都沒先煮過，RIPA看資料說是強力的lysis Buffer，
內含的ionic detergent已可破壞protein-protein interaction，
但是學長說要煮才對，不知道是不是我認知錯誤?
可是也有人說不用煮。
雖然先煮過理論上是可以保證非共價的interaction會被破壞，
但又怕太激烈ubiquitin的共價鍵會斷 (理論上是不會斷啦...實際上就不知道了)。
2. 若lysate有點黏稠(DNA釋出?)，是否可用sonication將其震過?
sonication會不會讓ubiquitin鍊斷裂? (共價的DNA分子都可以斷的話...)
3. 我查網路上的資料，RIPA的環境下應該可直接進行Ab和target protein的binding，
但還是怕裡面的SDS太強，所以用PBST稀釋了，不知道這樣可不可以?
如果可以，能再用更多的PBST把RIPA稀釋嗎? 還是需要改用其他buffer?
4. Pre-clear是否為IP必要步驟?
Pre-clear可再加IgG isotype去除樣本跟IgG的非特異性結合嗎?
5. IP後的wash該如何操作較適當?
IP完之後的wash是否可以小力vortex懸浮磁珠，
還是說只需用wash buffer將磁珠沖過就好?
6. IP之後的wash是否可減少到2次?
因為我要看的是target protein上面ubiquitination的程度，
以前的朋友說看ubiquitination的話不能洗太多次。
7. Elution時是否需震盪?
我最後要從磁珠上elute蛋白時會用 1,000 rpm 震盪讓磁珠在加熱時懸浮，
想說讓elution比較完全，還是說根本完全沒必要震盪?
8. 跑膠Loading Sample時可否將磁珠一起load進去?
因為Elution後，雖然利用強力磁鐵分離磁珠，
但是還會有大概 5 uL 的Sample會殘留在磁珠團中，
不知道可不可以將磁珠一起load進去，減少Sample損失?
9. 用light chain-specific secondary antibody (monoclonal)
去認polyclonal rabbit primary antibody是否不需考慮認的light chain
是lambda還是kappa型的?
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先感謝兩位板大指導...Protocol那邊我會再去問的
用MG132替代NEM加到lysate裡可以嗎? 剛好有現成的
磁座小弟是有用...只是磁珠被吸附後還是會沾黏部分液體，加上煮的時候會蒸發，
所以常常加40uL煮，最後只能回收30uL左右，
還是說根本不需顧慮損失多少體積，load膠時體積一樣就好?
另回W大，是要看total的。
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