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Re: [求救] 釣出全長序列，未知基因

看板Biotech (生命科學)作者 (ED)時間12年前 (2013/06/09 04:36), 編輯推噓1(1推 0噓 21→)
留言22則, 4人參與, 最新討論串3/3 (看更多)
請問，老師說我必須抽 genomic DNA做Southern blot, 將promoter, introns片段clone出來, 序列讀出來, 怎麼辦!!我完全不懂Southern blot找全長?? 跪求ORZ!! ※ 引述《puec2 ( .＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿.)》之銘言： : ※ 引述《EDONIS (ED)》之銘言： : : 請問由於用cDNA library的方法 CLONE到一段序列 : : 是片段序列，老師希望我能把這序列的全長拿到!! : : 在去比對看是甚麼。請問這能RACE的方法來做嗎?? : : 還是?? : 假設你找到的東西在Genebank上面沒有 : 那你可以... : 1. 丟BLAST找最接近的基因(總不可能是你排骨開天第一人吧) : 2. 用找到的已知基因去做BLAST後 取最接近的前十個hit做multiple alignment : 3. 找到conserved region(總不能可能你是排骨開天第一人吧) : 4. 從 conserved region設計primer 如果conserved region不夠長就設計 : degenerate primer primer的3' 最好是放在conserved region上面 : 5. PCR, TA cloning, sequencing : 6. RACE有點麻煩 其實不用這麼麻煩的 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 123.195.13.23
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你之前不是有說過要做RACE? 老闆不接受嗎
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不接受!!叫我用Southern blot，我完全不懂怎麼用>"<
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Southern blot怎麼求全長 真不可思議
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06/12 19:44, , 4F
老闆可能看過 "第一次做DNA就上手" 這種書吧
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推
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用southern釣全長是傳統方式
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先跑southern用原po的fragment當probe
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理論上只會出現一到兩個band 然後再跑一次southern
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把band相對應位置的gel挖下來去做cloning
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因為是southern 所以理論上上面的band都是有切位的
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直接塞進vector就好
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得到的整盤colony再去做colony hybridizaion 找出帶有
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一樣是用原po的fragment當probe 這時候會有訊號的colony
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裡面就有可能帶有全長
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最後對應回去 把colony挑起來 放大 抽plasmid
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就可以了
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southern我知道可以用dig
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colony hybridization以前看人家都用isotope做
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因為dig出現的時間點 大家都轉向做模式生物 都是有genome的
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現在還能做到這種實驗 難得阿 難得
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新手搞這個要搞一年吧
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然後參考的方法和paper的作者應該退得退 死得死 XDDDDDD
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做得順手的一個流程也要各把月了，這方法真是匪夷所思XD
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