[求救] 蛋白質破菌方法

看板Biotech (生命科學)作者EDONIS (ED)時間12年前 (2013/07/11 18:55)推噓2(2推 0噓 0→)

留言2則, 2人參與討論串1/1

1)挑取培養皿上單一菌落，培養在 15 mL 之 LB/amp/kan 液體培養基中，以 120 rpm 轉速震盪，在 37℃ 下培養過夜。 2)取上述菌液 6 mL 加入 300 mL 新鮮 LB/amp/kan 培養基中，以 120 rpm 37℃ 培養至 A600 = 0.6 後，加入 IPTG 成為 1 mM 濃度，繼續以 120 rpm 在 37℃ 震盪培養 4 h。 3)將菌液倒入 50 mL 離心管 (conical tube) 中離心 10 min (5,000 rpm)。 4)倒去上清，可將菌塊連同離心管置 -20℃ 冰箱貯存。 5)取出含菌塊之離心管置碎冰上，待菌塊溶解後，以殘存液體均勻懸濁之。再加入 10 mL lysis buffer 輕輕懸浮之。 6)將菌液放在液態氮中冷凍 1 min，然後在 37℃ 水浴中搖盪溶解之。如此反覆三次，儘量不要產生大量氣泡。將離心管的內容物倒入 50 mL 高速離心機的離心管內。 7)離心 20 min (12,000 rpm, 4℃) 取上清共 _____ mL，稱為粗抽取液 (XT)；預留 100 贡L 以便日後一起進行分析。阵此後樣本均得放置碎冰上，以低溫進行實驗。 8)此上清加入 5 mL buffer A-0 混勻後倒入燒杯，置碎冰上放冷，不時攪拌並緩緩加入固體硫酸銨 _____ gm，使成為 70% 飽和度，加完後再攪拌 10 min。參照表 4.1 找出該體積所要加的固體硫酸銨，以達 70% 飽和度。 9)離心 20 min (12,000 rpm, 4℃) 後小心倒去上清，取白色沈澱部份。 10)沈澱加以 2 mL buffer A-150 均勻懸濁之，再以桌上型離心機去除不溶物質， (10,000 rpm, 5 min)，共得 ______ mL，稱為全蛋白質 (TP)；預留 100 贡L，連同上述 XT 置 4℃ 冷藏。 11)其餘溶液部份準備進行膠體過濾層析，標示清楚後置 4℃ 冷藏。網上查到這步驟表現蛋白，因為實驗室沒有超音波機。想請問+LYSIS BUFFER破菌後離心取得上清，下面沉澱物，假如是膜蛋白有可能會在下面嘛??是不是也要把沉澱物也拿來繼續進行跟上清一樣的步驟後跑膠，看有無表現 ???因為我尋問有相關經驗的，他說他是IPTG誘導後，離心後用PBS溶，然後超音波破菌20~30MIN後離心，上清跟下面沉澱都跑膠。那用液態氮破菌的，是不是也可以直接用PBS溶，離心後上下都跑膠??就不需經過下面步驟??目前單純看蛋白質有無表現。感謝~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 123.195.13.23