[求救] real-time PCR Ct值疑問

看板Biotech (生命科學)作者 (賤仔翔)時間12年前 (2013/08/07 11:17), 編輯推噓1(1015)
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發問時請注意,若是要問實驗相關的問題,請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 以方便板友幫您追蹤問題 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- 每次做real-time PCR,做四重複,結果Ct會產生兩兩分群的現象,也就是數值兩個兩個 相近,造成取值非常的困擾,但是melting curve卻是很有專一性的,之前懷疑是pipet error的 現象,所以嘗試放大體積來加cDNA,可是結果沒有甚麼差異!?請問有板上的大大有有類 似的經驗嗎? 另外加試劑的順序,氣泡存在與否,是不是會造成影響呢? 我的順序為先加水、sybrgreen、Primer混合成一管mix,分別加入8聯排,再加入 cDNA,希望大家可以幫幫我啊QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.4.209

08/07 11:33, , 1F
氣泡在一開始加熱時就會破光了吧?
08/07 11:33, 1F

08/07 11:35, , 2F
順序的話通常是體積大(水)先加, 原po寫的應該沒什麼問題
08/07 11:35, 2F

08/07 11:43, , 3F
換一排做 可能某幾個孔加熱有問題
08/07 11:43, 3F

08/07 12:03, , 4F
那pipet要到第二段嗎,感覺sybrgreen mix 都會殘留
08/07 12:03, 4F

08/07 14:13, , 5F
我去的實驗室是不用8連排的..
08/07 14:13, 5F

08/07 14:14, , 6F
我都不用第二段 我覺得第二段出來有時候會黏在tip上
08/07 14:14, 6F

08/07 14:23, , 7F
不推第二段,ct會跟之前的data有所差異吧,是mix還是cD
08/07 14:23, 7F

08/07 14:23, , 8F
NA不推二段
08/07 14:23, 8F

08/07 23:29, , 9F
我的話會水跟cDNA mix在同一管,primer跟SybrGreen
08/07 23:29, 9F

08/07 23:32, , 10F
一管,不過我的問題是你這現象實驗室其他人也有嗎?
08/07 23:32, 10F

08/07 23:32, , 11F
數值兩群差距有多大? 如果方法對,做三重覆即可,偶數組重覆
08/07 23:32, 11F

08/07 23:33, , 12F
有點自找麻煩哪...
08/07 23:33, 12F

08/07 23:34, , 13F
如果其他人也有, 我懷疑是機器或tube的問題
08/07 23:34, 13F

08/08 00:46, , 14F
如果cDNA降解會這樣嗎?
08/08 00:46, 14F

08/08 00:46, , 15F
其他人也有Q_Q
08/08 00:46, 15F

08/08 11:31, , 16F
兩組ct大約差0.7-1.5
08/08 11:31, 16F
文章代碼(AID): #1I0RnM9M (Biotech)
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