Re: [求救] real-time PCR Ct值疑問

看板Biotech (生命科學)作者ljii (是否)時間12年前 (2013/08/14 14:46)推噓1(1推 0噓 0→)

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※ 引述《naruto200420 (賤仔翔)》之銘言： : 每次做real-time PCR，做四重複，結果Ct會產生兩兩分群的現象，也就是數值兩個兩個 : : 相近，造成取值非常的困擾，但是melting curve卻是很有專一性的，之前懷疑是pipet error的 : : 現象，所以嘗試放大體積來加cDNA，可是結果沒有甚麼差異!?請問有板上的大大有有類 : : 似的經驗嗎? : : 另外加試劑的順序，氣泡存在與否，是不是會造成影響呢? : : 我的順序為先加水、sybrgreen、Primer混合成一管mix，分別加入8聯排，再加入 : : cDNA，希望大家可以幫幫我啊QQ : : -- : ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) : ◆ From: 140.112.4.209 : → roy047:氣泡在一開始加熱時就會破光了吧? 08/07 11:33 : → roy047:順序的話通常是體積大(水)先加, 原po寫的應該沒什麼問題 08/07 11:35 : → untilnow:換一排做可能某幾個孔加熱有問題 08/07 11:43 : → naruto200420:那pipet要到第二段嗎,感覺sybrgreen mix 都會殘留 08/07 12:03 : → huuban:我去的實驗室是不用8連排的.. 08/07 14:13 : → ai760721:我都不用第二段我覺得第二段出來有時候會黏在tip上 08/07 14:14 : → naruto200420:不推第二段,ct會跟之前的data有所差異吧,是mix還是cD 08/07 14:23 : → naruto200420:NA不推二段 08/07 14:23 : 推 mesenchymal:我的話會水跟cDNA mix在同一管,primer跟SybrGreen 08/07 23:29 : → mesenchymal:一管,不過我的問題是你這現象實驗室其他人也有嗎? 08/07 23:32 : → jsi:數值兩群差距有多大? 如果方法對，做三重覆即可，偶數組重覆 08/07 23:32 : → jsi:有點自找麻煩哪... 08/07 23:33 : → mesenchymal:如果其他人也有, 我懷疑是機器或tube的問題 08/07 23:34 : → naruto200420:如果cDNA降解會這樣嗎? 08/08 00:46 : → naruto200420:其他人也有Q_Q 08/08 00:46 : → naruto200420:兩組ct大約差0.7-1.5 08/08 11:31 ct差1其實就有點多了, 這表示RNA 量差了2倍左右, 如果你RNA是要看2-3倍的fold change那error會超大. 但如果是那種100 fold之類的差異就還好 melting curve是看你的primer有沒有亂anneal melting curve正常還是不能排除你在pipette的variation 聽起來最有可能的還是pipette的誤差我自己的經驗是我們lab習慣是18ul的master mix加2ul的sample master mix在加之前要vortex足夠, 之後每個well 加18ul的動作, 不要換tip, 推pipette盡可能等速而且不要太快 (太快會有部份殘留在tip), 我自己是會推第二段, 重點是要看到tip全空同一個master mix的所有well用同一個tip, 然後tip盡一切可能每次都排空加sample時也是要先vortex足夠然後慢慢加. 一開始學RT-PCR時會怕taq開始nonspecific 所以想盡快, 但後來發現這是杞人憂天, 只要你的plate在冰上, 幾乎不會有問題. 所以不如穩穩的確認每次master mix跟sample都排空. RT-PCR因為太sensitive所以一點點小差異一被放大就差很多所以盡可能在加每個動作時都龜毛到極點, 有些定性的實驗像PCR, 其實你buffer啊水啊差個0.1ul其實根本沒差, 但RT-PCR就是要斤斤計較, 我甚至後來setup plate時都不聽音樂, 而且要在人最清醒時作, 狀況不好時容易出錯因為我們lab看的東西常常是3-5個fold的差異而已, Ct差超過0.5就很可能不能相信了. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 108.66.112.241