[求救] 新手想仔細請教電穿孔法步驟

看板Biotech (生命科學)作者a72830044 (a72830044)時間12年前 (2013/09/04 01:33)推噓0(0推 0噓 4→)

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小弟目前正要開始嘗試用電穿孔法 overcross兩段基因大致上的流程是懂了，但是一些細部的部分不是很了解從一開始拿出-70度C的菌液就不太懂 1.拿出菌液後置於冰上，待其微溶時取 5ul加至 5ml培養液中震盪隔夜培養 2.隔日從過夜菌液中取 50ul加入 10ml培養液中震盪培養 2hr開始每20分鐘測一次OD 3.待OD=0.5時冰浴10分鐘，在4度C下以4000rpm離心10分鐘 4.倒掉上清液並以 10ml滅菌水輕輕的沖混，然後再同條件離心10分鐘 5.倒掉上清液並以 5ml滅菌水輕輕沖混，以同條件離心10分鐘 6.最後加入 1ml含10%甘油的冰冷溶液沖混，後以 100ul分裝保存於 -70度C 第一個疑問，步驟1 這樣是可以的嗎？還是要先做一些處理？第二個疑問，步驟5 當中所提到個甘油溶液是甘油+滅菌水？第三個疑問，如果我今天要進行電穿孔法了，那含甘油的勝任細胞是直接可以使用？第四個疑問，我在其他crossover的文獻上有看到設計另外一段篩選的基因如果是電穿孔完、塗plate然後直接送定序檢查這樣需要設計那段基因嗎？最後一個問題...小弟的質體總長度大概 8K bp左右用一般的熱休克法可能成功做出crossover嗎？在質體上共有前後各 50bp的同源序列而同源序列夾住的基因長度約 1.6K bp，欲取代位置的基因長度也約 1.6K bp 如果有缺條件的我會再補述感謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.163.252.247

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是要做 Pseudomonas putida的電穿孔嗯...第四個問題我基因丟進去之後會製造PCA，我是打算配plate，加入會使PCA顯色的藥品進而挑選有使周圍變色的菌落 ※ 編輯: a72830044 來自: 140.123.126.147 (09/04 11:20)