Re: [求救] 請高手幫忙看看這幾張Annexin V/7AAD圖

看板Biotech (生命科學)作者tharaohfu (我的最愛全不見了....)時間12年前 (2013/09/24 04:26)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《truthPP (就是真理)》之銘言：晚上睡不著.... 以下用自己的經驗來回答一下 : 大家好 : 詳細圖檔於下列網址內 : http://ppt.cc/N7Cy : (如果PCMAN開不了換至Google chrome應該ok) : 實際的實驗內容我在先前annexin V/7AAD的提問(15388篇)中有說明 : 今天做完的結果 : 感覺好像設定上還是沒抓到竅門 : 所以前來請有做過Annexin V/7AAD的高手指導一下 : 先簡單說明圖中各項組別 : (A)未染色的活細胞Control 其實control組應該還是要加dye下去染的才算真正的control 就像一般的flow實驗要加isotype IgG conjugated dye一樣先用FSC和SSC gate出主要的活細胞群如果你是用BD canto以上等級的機器還可以再用FSC-A和FSC-W 把不是單一細胞的群落去除上機的時候記得在DIVA軟體中把A和W的訊號參數打勾就好因為你沒有任何的treatment 這樣加dye下去染色後的data才算真正的control (我不確定calibur能不能測到W的數值) : (B)照射UV後4小時的細胞單染Annexin V : (C)照射UV後4小時的細胞單染7-AAD : (D)雙染Annexin V及7-AAD的活細胞Control : 上述四組用於調整設定 : (E)照射UV後4小時的細胞雙染Annexin V以及7-AAD : (F)加入誘導凋亡藥物5nM兩小時後的細胞雙染Annexin V以及7-AAD : (G)加入誘導凋亡藥物50nM兩小時後的細胞雙染Annexin V以及7-AAD : 上述三組為實驗組 : Flow上機後調整的方式為 : 1.先上未染色活細胞control(形成A圖) : 目的:調整FSC/SSC以及FL2跟FL3至理想區域及象限 FL2和FL3 gain值再調大點吧 positive 訊號到10^3會比較清楚甚至你可以分出早期和晚期的apoptotic cell : 2.上照射UV後4小時的細胞單染Annexin V : 目的:調整FL3-FL2 compensation : 3.上照射UV後4小時的細胞單染7-AAD : 目的:調整FL2-FL3 compensation : compensation最終設定大約值是 : FL3-FL2=14% : FL2-FL3=28% 要做螢光補償前要先把 1.FSC和SSC的gating範圍先確定 2.FL2和FL3的gain要調到有明顯positive訊號的值再來做補償才會準以你的圖完全沒做gating來看的話我看圖中的FL3螢光補償還不夠喔因為單染7AAD的positive訊號還是斜的... 至少要把C圖中的FL3 postive訊號拉回FL2 10^1以後的位置但前提是你一定要先確定你的gate範圍因為細胞碎片和aggregated cell會影響螢光補償的結果 (像是SSC-H最上面那一排密密麻麻的訊號...) 尤其是當你要的positive細胞只有1%以下又是拖尾訊號的話就一定要注意 : 4.上雙染Annexin V及7-AAD的活細胞Control : 目的:確認十字範圍設定baseline 這才算真正的control(就是D圖) 你看你的A和D圖形就不一樣了好的negative control A和D的圖形要差不多才是 : 5.完成設定後依序上後續實驗組 : 跑完後對data的疑問 : 1.照射UV的細胞感覺好像沒甚麼死= = : 在跑UV單染的圖出來時 : 當下的反應是 : X!(消音)不會沒染上吧? : 但後來看到藥物組的圖形有出來 : 感覺應該是有染上 : 反而更疑惑UV組到底出甚麼問題從FSC-SSC看起來死蠻大的啊XD 一堆細胞碎片和屍體 : 2.UV部分的Data感覺細胞群好難抓所以先沒有gate : 不知道這邊的細胞能Gate哪一塊區域? http://ppt.cc/SByv 這是你第一組的圖紅色部分表示形態正常的細胞藍色部分代表正常處理下產生的細胞碎片照你UV組的圖來圈的話如果是我我會圈綠色部分來gate 如果你保守一點也可以用紅色部分來做gate : 3.實驗的組別設計上不知道大家看完有沒有覺得哪邊有問題? : 會不會是實驗組別設計上(特別是調整設定哪幾管)的問題 : 才會導致圖形變這樣 UV induced apoptosis我記得不同燈管瓦數放的時間也不一樣還有你放的距離等等都有關係建議你先去找一個positive control 先確定SOP Jurkat 應該是個理想的cell line 然後把你的target cell的gate和螢光補償搞定再來看吧 : 4.一般來說染色的時間大家大概最長到多少? : 我從下Annexin V/7AAD到上機是15分鐘冰上15分OK 如果你跑sample需要很久的時間細胞fix之後再上也可以 0.4%paraformaldehyde in PBS solution很好用配製方法去估狗一下就行了調PH值很麻煩而已實驗室很有錢就買commercial的就好 : 目前這組DATA唯一給我的好消息是 : 如果他是OK的 : 那藥物組(G)可能就是我要的條件 : 但那也要DATA是OK的 T皿T : 而且看到UV組的圖是那樣好像都還活得好好的感覺冏 FSC和SSC的圖看起來活得不怎麼好啊XD 不用太擔心啦要相信你的UV燈管啊!!! : 希望大家能對我設定上以及實驗組別設計的部分給我建議 : 因為這細胞凋亡條件對我來說很重要 : 懇請大家幫忙 : 先跟大家說聲謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 182.235.48.215 ※ 編輯: tharaohfu 來自: 182.235.48.215 (09/24 04:27)