Re: [求救] PCR primer帶有GGC重覆的序列

看板Biotech (生命科學)作者microball (無華之果)時間11年前 (2014/04/21 05:19)推噓0(0推 0噓 1→)

留言1則, 1人參與討論串2/2 (看更多)

※ 引述《MDCCLXXVI (1776)》之銘言： : 最近要在一段蛋白質前面加上GGGGS四重覆的linker : 所以5' primer帶有下面的序列: : ggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagc 這種 tandem repeats 在 PCR 或一般 DNA 複製本身就容易有 insertion/deletion 突變所以我建議，既然你關心的只是 amino acid 序列， Glycine 可以有不同的 coding 方式，不要都用 ggc 這樣就能避免 tandem repeats 造成的突變 : 但將PCR(用phusion polymerase,band很乾淨)產物clone定序後， : 發現在linker中的序列有deletion(少10幾個mer) : 因為不同clone的deletion都不一樣，所以應該不是primer合錯了 : 想過是不是GC-rich造成的二級結構所影響 : 所以打算用下面的方式試試看 : 1. 用phusion polymerase GC buffer for GC-rich template : 或 : 2. 加DMSO : 請問有人有類似的經驗嗎? : thx~ 這種 tandem repeats 的突變，跟點突變不同，不容易避免加 GC buffer 可能會讓 PCR 產量增加，但正確率不一定會提升至少我們實驗室做過 AC- repeats 序列的實驗，加 GC buffer 影響不大 -- 也許有一天，我們會很有默契的知道，該各自往人生的路走下去，儘管捨不得對方的陪伴。又也許，那一天一直不會來到，那我們就擁有童話般的結局──永遠在一起了。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 128.122.3.250 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1398028750.A.BAD.html