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[求救] 請教transfection失敗的原因

看板Biotech (生命科學)作者 (找英文家教)時間11年前 (2014/12/02 15:20), 編輯推噓6(6推 0噓 27→)
留言33則, 5人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
請教各位先進， 我想要knockdown Axl(屬於一種receptor tyrosine kinase)， 使用plasmid pLKO.1與Polyjet(一種reagent)， 實驗分成control(不處理), scramble control(空的vector), knockdown 結果相較於control，scramble control與knockdown這兩組的Axl(target gene)都有 下降(但我預期看到的是僅僅knockdown這組有下降) 想請問可能的原因有哪些？ PS: (1)scramble control學理上要放non-target sequence，但實驗室沒有這種control (2)先前實驗室有做過GFP測試是OK的，約在transfection 24小時候收細胞 (3)transfection時間的排程:如今天下午五點transfect(plasmid與polyjet in serum-free medium, 然後放入有serum的medium 1cc)，明天下午早上八點換medium， 後天早上八點收細胞，通常都會看到有transfect的組別細胞會死3-5成 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 210.60.122.151 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1417504802.A.8A0.html
推
12/02 22:18, , 1F
我建議你降低polyjet 的量再做一次看看，有時候過多的rea
12/02 22:18, 1F
→
12/02 22:18, , 2F
gent 會影響細胞的基因表現。
12/02 22:18, 2F
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12/02 22:28, , 3F
您的建議聽起來合理,一般建議polyjet:DNA around 3:1
12/02 22:28, 3F
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12/02 22:30, , 4F
慮您的建議，謝謝！
12/02 22:30, 4F
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12/02 22:32, , 5F
本實驗室先前測試4:2效果最好(是前輩,不是我)，我會考
12/02 22:32, 5F
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12/02 23:49, , 6F
"做過GFP測試是OK?" 是指一般cds vector而不是shRNA吧？
12/02 23:49, 6F
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12/02 23:51, , 7F
shRNA都偏大,如果用一般GFP測試OK,應該只能說polyjet可用
12/02 23:51, 7F
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12/02 23:52, , 8F
要反映出4:2的比例最好,可能很沒說服力
12/02 23:52, 8F
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12/02 23:53, , 9F
尤其GFP又只做24小時,這應該只看有表現而不是表現比例吧?
12/02 23:53, 9F
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12/02 23:56, , 10F
我用幾家不同的經驗都顯示plasmid越大,對應reagent該越多
12/02 23:56, 10F
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12/03 00:05, , 11F
以上不見得解決眼前問題,只是覺得既有的測試設計並不適當
12/03 00:05, 11F
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12/03 00:39, , 12F
所以請問B大對我的實驗,vector就造成target gene表現下
12/03 00:39, 12F
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12/03 00:40, , 13F
降,有沒有具體的測試方法或可能原因，謝謝！
12/03 00:40, 13F
推
12/03 16:45, , 14F
不負責任的建議︰做不同時間點收細胞來看表現量
12/03 16:45, 14F
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12/03 16:47, , 15F
也許你就會知道什麼時間收細胞會比較好
12/03 16:47, 15F
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12/03 16:50, , 16F
還有表現量下降，是用Q-PCR測的嗎？差很多嗎？
12/03 16:50, 16F
推
12/03 16:56, , 17F
scramble、knockdown的下降量會差很多嗎？
12/03 16:56, 17F
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12/04 13:44, , 18F
表現量是從protein來看,scramble與knockdown相較於contr
12/04 13:44, 18F
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12/04 13:48, , 19F
ol約下降1/3,但knockdown與scramble兩者差不多
12/04 13:48, 19F
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12/04 13:49, , 20F
如果用RT-PCR加上跑電泳與Image J定量,control,scramble
12/04 13:49, 20F
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12/04 13:50, , 21F
knockdown三者差不多
12/04 13:50, 21F
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12/04 18:40, , 22F
順便在問一個無助解決的你推文疑問的,你已經確定shRNA可用
12/04 18:40, 22F
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12/04 18:41, , 23F
了嗎？ 通常這類實驗不work,transfection並不是優先煩惱的
12/04 18:41, 23F
推
12/05 03:00, , 24F
housekeeping gene結果正常嗎?
12/05 03:00, 24F
推
12/05 14:17, , 25F
默默地推bl大，如果是我的話，我會另外做幾組把抗生素
12/05 14:17, 25F
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12/05 14:20, , 26F
的量，加到2倍、3倍等，然後你要想你要做的是
12/05 14:20, 26F
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12/05 14:22, , 27F
transient transfection或stable transfection？
12/05 14:22, 27F
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12/05 14:23, , 28F
再去看一下抗體認的位置是在knockdown序列之前，
12/05 14:23, 28F
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12/05 14:25, , 29F
還是在knockdown序列之後？scramble多放幾天看表現量
12/05 14:25, 29F
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12/05 14:26, , 30F
會不會變得跟normal差不多？
12/05 14:26, 30F
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12/05 14:28, , 31F
還有就是RT PCR的primer，要跨過knockdown的序列，
12/05 14:28, 31F
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12/05 14:29, , 32F
這樣你才會知道knockdown有沒有效果，
12/05 14:29, 32F
推
12/05 14:36, , 33F
從你RT PCR的結果，很難推定你的knockdown是有效的~~~
12/05 14:36, 33F
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