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[討論] Gibson Assembly 無法成功接上

看板Biotech (生命科學)作者 (sharkhsu)時間10年前 (2015/03/28 11:40), 10年前編輯推噓5(5推 0噓 18→)
留言23則, 6人參與, 最新討論串1/1
目前打算將vector和insert利用Gibson Assembly接上，再transform 到DH5a，但沒想到塗盤後都沒有長任何菌。因此想要請問各位有嘗試 過此法的人，有沒有什麼經驗、方法可以提出來參考的呢!? primer設計完，並利用snapgene確認可ligation後， 把vector double digestion(NcoI、DraIII)、insert 分別切膠純化 vector 長度為3200bp、insert為2500，兩者跑膠確認無誤。 按照NEB的protocol : vector 實驗中加入 2μl (50ng) insert 4μl (150ng) Gibson buffer 10μl DIW 4μl -------------------------- Total : 20μl 之後再50℃反應15 min → -20 ℃保存，以準備transform用。 Transformation : 上述溶液稀釋4倍，將2μl加入50μl的勝任細胞，混合完冰浴30moin →42℃熱休克30 s → 冰浴2 min → 加入950μl LB後於37℃培養1hr → 200 μl菌液 塗到palte上(抗amp) → overnight培養 ---------------------------- 步驟大約如上，但還是沒有長任何菌 ..之前有將gibson完的溶液跑膠， 卻只有看到2800 bp的一條band，也不曉得問題出在哪! .. 可否請高手分享相關的經驗呢!? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.35.165.133 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1427514019.A.906.html ※ 編輯: shunminhsu (114.35.165.133), 03/28/2015 11:41:19
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03/28 18:47, , 1F
切膠純化是用什麼方法？最後 DNA 回溶在什麼 buffer 中？
03/28 18:47, 1F
推
03/28 18:59, , 2F
跑膠圖片可以放上來嗎？只有一條band表示另一段壞光了？
03/28 18:59, 2F
呃. . 步驟主要是利用binding buffer將膠片溶完後，再利用spin column和washing buffer 洗淨。 回溶是用EB .. 目前身上沒有膠片圖 囧" 對於另一段壞光目前是沒有想法.. 畢竟分開跑都有band .. 但一起跑就出現2800bp，最有可能就是此產物為線性... ※ 編輯: shunminhsu (36.239.40.203), 03/28/2015 20:21:47
推
03/29 00:34, , 3F
兩片段請用水回溶 50度C作用完的產物直接取10ul去轉
03/29 00:34, 3F
謝謝您的建議，我會再試試看
推
03/29 00:35, , 4F
vector cutting離recombine的地方多遠？我之前經驗是若
03/29 00:35, 4F
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03/29 00:36, , 5F
兩者離得太遠(>幾十bp)enzyme作用時間要長一些才能成功
03/29 00:36, 5F
推
03/29 00:42, , 6F
*cutting site
03/29 00:42, 6F
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 03/29/2015 08:21:39
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03/29 10:58, , 7F
我没用過這Gibson Assembly。Invec和penguinbb的方法都很實
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03/29 10:59, , 8F
用，畢竟你的 insert 頗大。或許作用時間加長會有效。DNA 回
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03/29 11:01, , 9F
溶最好是在水中，以免 buffer 影響酵素活性。如果怕量不夠，
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03/29 11:02, , 10F
可以一開始就用大一點的量。另外，以前傳統方法中，ligase
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03/29 11:03, , 11F
作用時都會加ATP，作用後也會放72℃來 heat inactivated。可
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以增加點 transformation 的成功率。
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03/29 19:56, , 13F
好奇問72℃ heat inactivated效果會好到有差異嗎@@
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03/29 19:57, , 14F
是為了不讓ligase不亂抓plasmid??
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03/29 23:32, , 15F
記得 datasheet 上寫 10%。但没有仔細比較過。
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03/30 00:14, , 16F
我剛剛看過 protocol，計算了一下你初始 DNA 的量。似乎少了
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一到兩個數量級。另外，50℃作用可以再延長些。 最後再問一
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謝謝ice大熱情的回答，因為protocol上建議vector的量大約在50-100ng之間，所以 我才加50ng進去，insert是建議>vector2倍以上，所以才加150ng...。 目前只能先試試看將片段回溶於水中和拉長反應溫度了。
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你的 DIW 是什麼？廠商没賣這東西啊。
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DIW(deionized water)不少cloning jit會附
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※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 03/30/2015 08:53:06
推
04/16 13:29, , 20F
最近做了兩個 constructs (7+7.8/7+4.3 kbp)
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我同時用 Gibson Assembly 和 In-fusion 做，
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結果 in-fusion 大勝。目前正在等定序結果。
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04/16 13:31, , 23F
如果你的 overlap 是 15 bp 的話可以考慮換 kit 試試
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