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[求救] 純化蛋白

看板Biotech (生命科學)作者 (CPU)時間10年前 (2015/09/01 01:53), 10年前編輯推噓7(7推 0噓 38→)
留言45則, 9人參與, 最新討論串2/2 (看更多)
目前自己用E.coli產帶有His tag的protein 因此會利用Ni+ affinity beads去抓下來 主要步驟為 1. 15ml sample跟beads(50ul)在旋轉盤binding O/N 2. 利用column(空的)把beads留住 3. 用10mM 10ml imidazole來wash 4. elute 用250mM 200ul 就結果來看 有八成的蛋白(包含目標蛋白)都在flow through 一成多elute出來 雜質少 但是產率低 想問大家這個流程是否可以有修改的地方 希望能提高回收率 p.s.有人有用過vivaspin嗎 想問一下正確用法 按說明書做 用新的管子10ml sample離了"半天"只離掉下來5ml= = -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 118.166.210.112 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1441043637.A.97D.html
推
09/01 07:19, , 1F
vivaspin的樣品要進去之前都要過0.45或是0.20濾膜不然會塞
09/01 07:19, 1F
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09/01 07:20, , 2F
Flow through過高我猜是overload 進樣量要再調整
09/01 07:20, 2F
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09/01 09:09, , 3F
同意樓上, beads的結合量原本就不能預期太多
09/01 09:09, 3F
推
09/01 09:19, , 4F
先算一下你預估產量跟beads用量吧
09/01 09:19, 4F
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09/01 11:32, , 5F
所以有可能是beads量不夠囉?還是說減少loading量下手
09/01 11:32, 5F
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09/01 19:06, , 6F
敘述太少 無法幫您 要不要放個data圖 標清IN是濃縮幾倍
09/01 19:06, 6F
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09/01 19:07, , 7F
loading量佔樣本的幾% 順便看一下誘導前後的圖
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09/01 19:07, , 8F
題外話 我們用Talon Bead效率非常好 好到只要換tag就
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09/01 19:08, , 9F
想哭 因為其他tag的純化系統跟Talon比差太多
09/01 19:08, 9F
推
09/01 21:04, , 10F
vivaspin不好用啊～～
09/01 21:04, 10F
推
09/01 23:55, , 11F
請問是用哪個品牌的Ni beads?
09/01 23:55, 11F
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09/02 01:09, , 12F
sigma的
09/02 01:09, 12F
附上部分data http://imgur.com/9PON5JO
由左至右 依序是 induction前、後、加beads前、blank、flow through、wash、elute 菌液是養250ml 很明顯elute只有一點點 ※ 編輯: skywings28 (118.166.208.52), 09/02/2015 01:30:34
推
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用maker estimate一下你蛋白的表達量 廠商應該有beads bi
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nding capacity的資訊
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09/02 03:04, , 15F
如果你的beads不是像前面幾位版友說的量不夠
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09/02 03:04, , 16F
忘了問 你的lysate (binding buffer)有沒有含imidazole?
09/02 03:04, 16F
推
09/02 03:07, , 17F
不過感覺起來蠻像是前面版友說的你beads不夠
09/02 03:07, 17F
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09/02 08:00, , 18F
我曾經有跟你ㄧ模一樣的情況，也是用sigma的beads，後
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來把flow through再加入GE的beads，再純化ㄧ次，問題就
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解決，證明不是蛋白質與純化步驟的問題，完全是sigma be
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ads的affinity很差，根本與說明書上寫的差很多，小小經
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09/02 08:00, , 22F
驗與您分享！
09/02 08:00, 22F
推
09/02 13:52, , 23F
看起來幾乎不抓 在binding上就有問題了 你有確認過誘導
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09/02 13:54, , 24F
後的蛋白是在sup嗎? 另外可能要請你去查一下bead抓蛋白
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09/02 13:54, , 25F
的量 因為沒有標註到底每個lane是loading原樣本的多少
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09/02 13:55, , 26F
比如說 我IN有1900uL loading 5uL 就是5/1900
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09/02 13:56, , 27F
去估算這個東西可以幫助你追蹤蛋白跑哪去 不過初步看
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09/02 13:58, , 28F
會不會是珠子加太少?
09/02 13:58, 28F
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09/02 14:59, , 29F
flowthrough部分 我是in 10~15ml loading 12uL
09/02 14:59, 29F
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珠子capacity為 15mg/ml gel 上面有人說實際上更低
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09/02 15:03, , 31F
IN 指的是flowthrough整個的體積 還是煮蛋白的量?
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煮蛋白我是40ulsample +10uldye
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09/02 17:14, , 33F
那elute過後，煮beads的data有嗎？另外，你induced前後看來
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09/02 17:15, , 34F
差異似乎不大啊。Induction條件要再調？
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09/02 17:18, , 35F
還有，我不覺得雜質少啊。你把圖用photoshop調成和誘發前一
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09/02 17:19, , 36F
樣的畫面樣子，就可以看到其他bands也跟著出現。
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09/02 17:35, , 37F
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09/03 03:26, , 38F
如果你只染膠不做WB的話蛋白表現多嗎？
09/03 03:26, 38F
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09/03 12:26, , 39F
染膠的話其實主要的band 很弱 flow那個很明顯
09/03 12:26, 39F
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09/05 03:21, , 40F
你在南部嗎？我覺得這過程敘述很難說清楚，因為你做wb,
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我不知道你蛋白誘導量多少，也無法知道15ml含多少目標
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蛋白，破菌和純化buffer為何，為何要o/n孵育，誘導的蛋
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09/05 03:21, , 43F
白折疊正常嗎？做小量純化測試看看？bead是否有問題，
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09/05 03:21, , 44F
在南部可以約一下討論，甚至借你一些talon bead用看看
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09/05 03:21, , 45F
。
09/05 03:21, 45F
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