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急!! western blotting 一直壓不出來?

看板Biotech (生命科學)作者 (ㄚJ)時間9年前 (2016/03/30 23:52), 編輯推噓7(7推 0噓 34→)
留言41則, 10人參與, 最新討論串1/1
首po 排板有問題 敬請見諒 小妹我在western上卡關卡很久 想請教有經驗的大大們~~~一點小撇步 來做改善 我用細胞萃取蛋白質去跑的 要壓的東西是IRS-1(和磷酸化的IRS-1) 但一直都壓不出東 西 不知道有沒有有壓成功的大大 可以提供一點意見 我一抗用1:1000 二抗用1:3000 不知IRS-1是不是要萃到細胞膜才壓的出來 還是需要在做什麼來加強 才有辦法~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.40.81.120 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1459353153.A.AEB.html
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western 沒出來 ，可能的問題有太多了
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這個蛋白沒有很難壓 ！你先把positive 做出來
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什麼細胞 多少細胞 蛋白怎麼抽 loading control
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03/31 00:37, , 4F
有沒跑sds page 有沒染ponceau positive有沒壓出來
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一抗是哪隻 二抗是哪隻 大概的protocol
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03/31 00:40, , 6F
照你給的資訊就能debug出來大概可以去當算命仙了...
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我的實驗細胞是c2c12 細胞是用lysis buffer粹 一抗是IR
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S-1 二抗是老鼠 同一片膠actin都有出來就只有IRS-1沒有
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蛋白濃度度用到60ug
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如果很急，何不把內容講清楚? 還是不是從頭到尾做過?
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問抗體是哪隻的時候往往是在問番號 網路上幾乎都找的
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到評價
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還有你不會認為全天下的"lysis buffer"配方都一樣吧
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推
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細胞整顆拿去煮 不要離心
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推
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試過1抗hy o/n嗎? 提高一抗濃度?
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推
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lysis buffer要注意一下你的inhibitor
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western環節很多 出錯就GG 寫仔細一點吧
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推
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沒有cat. number連有沒有用錯二抗都不知道好嗎...
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03/31 21:45, , 19F
是壓endogenous or over-expressed IRS-1? 剛剛看了一些抗體
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03/31 21:49, , 20F
公司的WB圖，大多都有先刺激細胞或IP後再做WB. 推二樓說的，
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先去找確定有表現IRS-1的細胞作為positive control，來證實你
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用的抗體是有效的，或者換個人做做看，可能可找到問題所在。
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一抗cat.#2390和#3203
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不好意思 想請問什麼是刺激細胞
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我的做法是細胞分化完 再投藥等藥物作用時間到了之後收細
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胞 為了可以壓出磷酸化的東西 也有在lysis buffet加入磷
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酸酶抑制劑 等變性完後 就開始做WB的步驟 其它要跑的東西
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04/01 02:35, , 28F
都有壓出來 就只有這個沒有 以前曾經有壓出過 但就只有那
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麼一次而已
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04/01 02:39, , 30F
做不出來才是正常的，有band才有問題
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04/01 02:40, , 31F
用CST與Abcam(epitomics系列),尤其新手務必注意Rabbit mAb
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04/01 02:46, , 32F
該用的二抗,多瞭解實驗細節,才不會遇到這類非技術上的失誤
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04/01 03:05, , 33F
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04/01 16:36, , 34F
二抗用的是Rabbit mAb 前面打錯了抱歉
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推
04/03 03:00, , 35F
是total form也壓不出嗎? 還是只有phospho-IRS-1?
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04/03 03:01, , 36F
blocking buf 跑磷酸化蛋白建議用BSA泡不要用Milk
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04/03 12:33, , 37F
兩個都壓不出來 blocking buffe 用5%的BSA 用TBS-T配
04/03 12:33, 37F
推
04/03 19:54, , 38F
抗體有reuse嗎?新配試看看?
04/03 19:54, 38F
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04/03 21:58, , 39F
會重復使用 我重配試試看 可以請問有壓過的前輩 這兩個容
04/03 21:58, 39F
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04/03 21:58, , 40F
易壓嗎？
04/03 21:58, 40F
推
06/15 12:30, , 41F
我是做adipocyte tIRS非常容易壓 pIRS則比較難一點點
06/15 12:30, 41F
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