Re: [求救] 有關LC MS/MS的樣品製備

看板Biotech (生命科學)作者gary910729 (明天meeting換你報)時間9年前 (2015/11/24 15:50)推噓1(1推 0噓 1→)

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※ 引述《charlene822 (是喔)》之銘言： : 簡單敘述一下我的實驗 : 實驗室研究的某個A蛋白正常為monomer形式存在 : 但加入了B藥物後會隨著藥物濃度增加漸漸形成dimer : 而我想經由Mass知道他形成dimer是哪些胺基酸的片段或位置影響的 : 就我所知可以利用trypsin來做水解特定胺基酸的處理後再上機分析 : 我想請教的是:我們實驗室是用column純化出來的蛋白需要跑膠處理還是直接可以用純化 : 後加藥的蛋白來做比較? : 如果是的話蛋白濃度以及怎麼加入trypsin處理還有trypsin的量要加多少? : 小弟對於這方面一無所知有勞各位大大救命了感激不盡小弟從大二到碩二一直都在蛋白質體實驗室做實驗，以下是實驗室的經驗，給大大參考一下。再推文裡也有提到過，不管是monomer還是dimer，trypsin都會切，所以一定要用crosslinker進行處理，如DSP等。但我很懷疑的是打mass真的可以幫你解決你的疑問嗎? Crosslinked以後只要有Cys都會形成共價鍵，也不能讓你知道dimer的型成是那些 residue所貢獻的。你只能知道經過藥物treatment後dimer的量是增加的。 (可以比較treat藥前與藥後的cross-linked蛋白A的spectra count作相對定量) 要找出那些residues是重要的，只能透過mutagenesis去做。這是我個人的想法，可惜我才疏學淺，要其他大大幫忙這部分。在實驗方面，蛋白質要先跑膠還是直接做digestion，其實除了取決於sample的複雜性以外，還要考慮到digestion的efficieny。現在做digestion最普遍的方法有兩種，一種是in-gel，一種是in-solution。前者的efficieny絕對比後者好，原因不太清楚。詢問過蛋白質體中心後，它們認為原因是peptide在solution中是流動的，這樣會降低peptide與trypsin的碰撞機率。相反，在膠裡面的話會相對固定，trypsin就比較有機會進行作用。所以不管sample來源，推薦用in-gel digestion了。 protein量的部分，取決於你LC-MS/MS所用的analyzer是哪一種，我們家最常使用的是 Thermo LTQ orbitrap XL，號稱sub-femtomol都可以鑑定的到。但實際上也不會用這麼少，我的經驗是SDS-PAGE load 5ug protein都有很好的效果了。所以簡單介紹一下protocol: 1. Load 5ug protein跑SDS-PAGE 2. Coomassive染色，用水退染一下，band不要太深色。 3. 挖出你要鑑定的band，你可以用tip挖一個圓點做鑑定，也可以挖出一長條band。 4. 如果是長條band的話就把他切成一小塊，大小大概1mm^3，把膠粒放在eppendorf裡面 5. 進行退染，100% ACN dehydrate與25mM NH4HCO3 rehydrate，重複直到膠沒有藍色 6. ACN dehydrate後加入1-2 ul的 20 ng/ul trypsin (dissolved in 25mM NH4HCO3) trypsin的量這樣是一定足夠並多出一些的， 7. 冰上1小時，讓乾掉的膠塊吸取那1-2 ul的trypsin，這時候膠塊會變透明 8. 補上20 ul的25mM NH4HCO3，37度O/N 9. O/N後再補20 ul的NH4HCO3，用sonicater extract peptide 10. 真空抽乾 11. 回溶上機回溶的部分看你的LC的solution是什麼，我是用12 ul 0.1% formic acid回溶取10 ul出來放進mass的sample管子裡面，機器會取其中的7 ul打mass -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.82.187 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1448351422.A.0E2.html