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[求救] DNA Gel extraction的效率很差

看板Biotech (生命科學)作者 (鼻子好像灌太多了)時間8年前 (2016/06/09 00:26), 編輯推噓6(6推 0噓 54→)
留言60則, 12人參與, 最新討論串1/1
各位好，最近剛做gel extraction的實驗，但recovery的效率非常的差，想請各位幫幫忙。 我是先用2 microgram的plasmid先用限制酶切，分離後切下來，我所要的DNA大小約13kb。 接下來是使用QIAGEN的kit做gel extraction，步驟都照著protocol做，wash的步驟加buffer後有等一陣子再離心,elute的時候又是加了水之後等一陣子才離心。我是用15 microliter的量做elution。最後用nanodrop測濃度。 做了好幾次濃度都在1.5(ng/ul)，也太低了吧。 目前已排除plasmid切不完全的問題，因為不管切4hr還是切overnight濃度都差不多。 想問的問題是 (1)用kit內的elution buffer效果會不會比水好。 (2)elution buffer的體積會不會有影響。 (3)我們實驗室是用QIAGEN的PB buffer做binding,但protocol是寫QG buffer，雖然兩者都可以拿來做binding，但不知道效果有沒有差。 (4)有沒有其他的小細節要注意的，或是有其他更好的kit ----- Sent from JPTT on my Sony D6503. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 61.228.50.49 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1465403218.A.25F.html
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06/09 00:41, , 1F
你有看過manual上那張elution體積與回收率的關係圖?
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06/09 01:13, , 2F
有，但是同實驗室的人用相同體積做，濃度就是比我高十
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倍…
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06/09 01:55, , 4F
Elute 的溶液有沒有先加熱？用水和 TE 效果差不多，主
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要是差在 DNA 穩定性還有 EDTA 對後續實驗有無影響
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06/09 01:56, , 6F
我想問為什麼 protocol 寫用 QG 你還要用 PB buffer?
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06/09 02:12, , 7F
濃度就算高你10倍，回收率也才11%，也很慘
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推
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找人跟你side by side 做一次
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06/09 04:53, , 9F
PB buffer只適用於液狀的PCR product純化，本身沒有溶膠的成
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分，請改用QG buffer並注意膠塊大小與QG的比例，放65度C以上
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的環境，大約每5分鐘搖晃一下，看一下確保膠塊溶解後再過
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column
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06/09 05:06, , 13F
液狀的PCR純化也可以用QG buffer，但因含GITC，自己配QG的話
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成本比較高。
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06/09 07:13, , 15F
為什麼改用PB據說是因為更之前的學長姐在他的產品的pro
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tocol上把wash那一步的QG buffer劃掉 寫PB 之後大家都
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照著做 但那份protocol不見了… 我是新來的 我就上
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網看才發現是用QG 我自己也覺得很奇怪 但詢問學長姐的
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回答都是他們都照那份protocol做
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推
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我以前用這組覺得elute的體積太少elution
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的效果也不好我自己都加到30 microliter
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然後你的target size 13kb～這組可以抓到
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這麼大的DNA嗎？
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06/09 09:33, , 24F
建議是最大抓10kb 若超過的話elution buffer要加熱
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06/09 10:28, , 25F
以前没有kit時，用的是5-10 microgram切下去，分離後以電泳
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06/09 10:29, , 26F
在dialysis bag收集。之後再洗洗、沉澱回收。
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06/09 10:32, , 27F
有了kit，儘量不要隨意更動步驟，除非你知道差在哪裡。g大的
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06/09 10:34, , 28F
加熱建議最好試一試，13kb是相對大了一些，效率問題大。
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06/09 10:42, , 29F
建議再加大elution體積或再elute一遍。最後再蒸散些水份。
06/09 10:42, 29F
推
06/09 12:19, , 30F
我覺得Q牌很邪門，全世界都說讚但我遇到的三間實驗室
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06/09 12:20, , 31F
都用不順，後來改用Zymo就可以上到70-80ng/ul,
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260/280 > 1.9, 260/230 > 1.9 有人有在用Zymo的可以
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06/09 12:22, , 33F
分享我後來修改的protocol, 小細節注意一下產率就很好
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06/09 15:12, , 34F
https://goo.gl/EntM6n，QG & PB 是分別對膠體與液狀PCR設計
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06/09 15:15, , 35F
的純化binding buffer，至於你說的wash由QG改成PB是怕
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06/09 15:18, , 36F
guanidine鹽類殘留，膠體的溶膠步驟要用含GITC或NaI的buffer
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06/09 15:21, , 37F
並且膠體純化binding過cloumn後，在酒精wash前會用QG wash一
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06/09 15:22, , 38F
次可減少膠體殘留。若沒QG buffer溶膠，可以拿其他廠牌溶膠
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06/09 15:23, , 39F
buffer代替，成分大同小異。
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06/09 15:26, , 40F
你的產量低，可能一開始膠沒溶完全。溶膠請用QG，wash可改PB
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wash一次，再用80%酒精或kit的 Wash Buffer(要加酒精) wash。
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06/09 16:10, , 42F
sorry 上頭寫錯，改PB不是減少guanidine鹽類殘留，因為PB成分
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是guanidine-HCL，而QG是guanidine thiocyanate，都有Gu鹽。
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06/09 16:43, , 44F
謝謝大家的回應回報最新實驗結果，今天我用了Q牌，gene
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aid(借的）和Q牌抽大sizeDNA的kit，全程照著protocol做
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06/09 16:43, , 46F
，elution的水有事先加熱且用30ul，建議多等的步驟也有
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做。
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06/09 16:43, , 48F
Q牌的濃度為2.5(ng/ul)，G牌為12.5，Q牌抽大kit為6.5
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06/09 16:44, , 49F
雖然量都有提升 但Q牌還是很低，想請問各位會不會是kit
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06/09 16:44, , 50F
壞了……因為他們放有點年紀了。
06/09 16:44, 50F
推
06/09 20:59, , 51F
也有可能，曾經一起比，放很久的kit回收率真的比較差
06/09 20:59, 51F
推
06/10 02:37, , 52F
你的 plasmid 是 empty vector 嗎？是的話也沒有想過用 ph
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enol/chloroform 試一下看看，我之前都是用這個做 cloning
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(cloning)，效果不錯，recovery 也高。
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Cloning (ligation)
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如果要乾淨一點的話就用 pcr purification 清一下，不然
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直接拿去做 ligation 也 ok。
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06/10 02:40, , 58F
Phenol/chloroform extraction
06/10 02:40, 58F
推
06/15 02:20, , 59F
我的經驗是Gel ext kit放久蠻容易失敗的 大家經驗呢
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06/15 19:32, , 60F
我記得column有效期？
06/15 19:32, 60F
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