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[求救] plasmid用insert primer P出vector??

看板Biotech (生命科學)作者 (phoebe)時間8年前 (2016/08/17 21:15), 8年前編輯推噓5(5推 0噓 50→)
留言55則, 6人參與, 最新討論串1/1
前情提要： 我用的vector是thermo的pJET1.2，大小2974 bp insert大小約4.2 kb，是用HiFI系列polymerase出來的blunt end產物，切膠純化 按protocol ligate後使用自製的competent轉型，amp篩 隔天長出約100個colonies 挑8個colonies抽mini，做RE digestion 沒切出預期的片段，只有Vector，沒有insert，或insert大小不對 但因為不信邪... 拿抽好的plasmid，用insert的primers跑PCR跑膠 結果八個都有跑出Band！！但都是vector的大小 (3000左右)！！ 不太明白為什麼會這樣... 是汙染的意思嗎？ 抱歉是Cloning新手，有爬文也和其他人討論過 之後會用別梯的PCR產物repeat實驗 但在這之前很想知道這次的結果代表哪個環節出了問題 謝謝！！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 118.165.158.16 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1471439728.A.67D.html ※ 編輯: kaofei (118.165.158.16), 08/17/2016 21:16:36
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08/17 21:21, , 1F
你會不會覺得那個3000,剛好是你加入的vector template？
08/17 21:21, 1F
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08/17 21:41, , 2F
我是這麼覺得的，但我不太懂為什麼會這樣...
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08/17 21:42, , 3F
因為我是用insert的primer去P的@@，怎麼會P出vector
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08/17 21:43, , 4F
還是說我其實也沒P出東西，是我vector濃到直接跑膠就有ban
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推
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其實這大小不用太多就會有band 了，用一管沒有p的跑看看
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08/18 01:31, , 6F
ligation有很多蟲可以抓 交代一下vector/insert如何
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處理 濃度 ligation condition唄
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08/18 19:16, , 8F
ligation是按protocol，22度C一小時，V:I=1:5
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08/18 19:18, , 9F
然後我今天用沒P的plasmid跑膠，果然出現3000bp的band...
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08/18 19:29, , 10F
算一下照protocol是不可能V:I有1:5的,肯定有算錯或誤解
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08/18 19:31, , 11F
而且這套我用起來幾乎不會有vector only,肯定pJET是過多
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08/18 19:36, , 12F
這次ligation是一個很熟pJET的朋友帶我做的，protocol上
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寫可以按比例調整ratio，不太懂為什麼不可能1:5？因為我朋
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08/18 22:04, , 14F
友都是用1:5去ligate的@@"，當天加的量也請他確認過。
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08/18 22:14, , 15F
vector有cip過嗎? primer 5'有phosphate嗎?
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1:5 量勒?
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pJET1.2用blunt-end cloning kit,不需cip或加P啦
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08/18 22:19, , 18F
protocol算一下,20ul reaction中取50ng pJET,依照1:5計算
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你的4.2k需要350g,佔全部20ul中的8ul,固濃度至少43.8ng/ul
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08/18 22:20, , 20F
如果是切膠純化用20ul水來elute,代表PCR產物幾近0.9ug
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08/18 22:20, , 21F
如果先不管切膠純化效率了,如果PCR若不混合5~10管如何辦到
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又如果這kit需要混合多管,顯示PCR效率不佳,也無法達如此量
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08/18 22:25, , 23F
最可能的解釋是用錯1:5的意義,造成vector加太多,導致最後
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colony長出一大堆不該長的false postive
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推
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我之前用過這個kit，建議:(1)vector only太多請用kit附
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的水(2)insert和vector的比例可多試幾種(3)ligation時間
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可以再長(如o/n)，反應溫度可用14或4度嘗試(4)確認你的
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片段可在你用的competent cell和temp.及抗生素濃度下
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cloning到
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08/19 02:03, , 30F
與其在這裡看半天考慮用哪個的建議不如多試幾種cloning
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謝謝大家的建議，但我不太懂B大的問題，如果我PCR產物有經
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過DCC，濃度不就能提高嗎？我測picodrop濃度是77ng/ul，故
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當時加的量約5，這樣應該有到350ng不是嗎@@還是我誤會了..
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然後想在請問B大說的false positive是指空的vector污染在
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plate上還是只competent cell吞進空的Vector長出來，我以
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吞空Vector不會長的...因為自接會induce lethal gene
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還是這個機制並不可靠??
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推
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我認為會導致false positive跟水乾不乾淨有關，kit附的
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水通常比較乾淨，如果是不乾淨的水容易混nucleotides，
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有機率卡在vector blunt-end，所以跑膠時就會看到跟
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vector類似大小的片段
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推
08/19 14:20, , 42F
b大說的是指加太多DNA到competent cell裡，DNA的體積應
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小於competent cell的10%，太多會影響轉形效率
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推
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至於這機制是否可靠，就我經驗若水夠乾淨挑到vector
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08/19 14:26, , 45F
only的機率不會太高 (約占10~20%)，如果是用從自來水做
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的sterile ddH2O機率會變很高
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08/19 14:28, , 47F
抱歉,樓上誤解我的說,我認為是加太多pJET,但insert不夠多
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導致太多pJET跟雜質(nt)接在一起,甚至兩兩自黏
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08/19 14:28, , 49F
如果要講濃度就用Qubit測,不然就用切膠前的band去評估量
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08/19 14:29, , 50F
因為一般狀況我不相信這樣的PCR會做出>500ng的純的產物
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08/19 14:31, , 51F
至於水,我們都是ddH2O滅菌後開來用的,通常用的V減少,我都
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08/19 14:32, , 52F
直接送seq不跑膠的,用這kit只需要檢查seq有沒有突變就好
08/19 14:32, 52F
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08/20 23:36, , 53F
抽好的 Plasmid，為什麼要 PCR 再跑膠？直接跑膠確認size不
08/20 23:36, 53F
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08/20 23:37, , 54F
不更快更省。頂多花半小時到一小時加RE切一切。
08/20 23:37, 54F
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08/21 17:29, , 55F
I大說的對，是我沒想通見笑了XD"
08/21 17:29, 55F
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