[求救] 請問大家多用哪一家polymerase?
想請問大家在construct基因的時候，
通常是用哪一家的牌子可以得到非常低的錯誤率?
最近在做一個約3K的基因，
要將其塞入pCMV-2A的質體，
花了快三周的時間確定整段序列正確(已經將整個CDS分四段定序完成)，
下一步做了八種不一樣的點突變，
原本只定序突變的位置，
(因為一次定序約800-1000bp，保守是600bp)
有同仁建議還是整段定序比較好(整段定序就要多花三倍的錢)
結果定序結果出來八個序列有三個出現各一到二個胺基酸(胺基酸真的改變)錯誤，
學理上可能不影響我的實驗結果，
但為了科學的真實性，
我還是又花了一周多的時間重作，
結果錯誤的三段裡面，
其中有二段基因還是錯誤，
而且錯的地方跟我第一次錯的地方不一樣，
因為定序是委託基龍..做的，
有爬過文，
看大家對他們的家的primers不大滿意，
所以我想是不是定序出現錯誤，
就在附近設計另一段倒回來的primer，
結果定序跟前一次相同(表示定序應該是OK的，訊號非常明確)
我使用的polymerase是NEB的Q5 DNA Polymerase，
業務跟我說是市場上最佳精確度，
比別家正確率高很多，
另外Pfu錯誤率為1/130,0000，
以我約3kb的大小，
錯誤率低於1/400，
但我這系列重組約14段(單一或數個點突變)，
其中有五段有問題，
出錯的機率也太高了！
不曉得各位版友，
大多使用哪家的Pfu來construct，
謝謝！
附註：我使用60度，30cycles，其他比例依照原廠(NEB)提供
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 210.60.122.154
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1475229939.A.646.html
→
09/30 18:12, , 1F
09/30 18:12, 1F
→
09/30 18:12, , 2F
09/30 18:12, 2F
→
09/30 18:19, , 3F
09/30 18:19, 3F
→
09/30 18:20, , 4F
09/30 18:20, 4F
→
09/30 18:20, , 5F
09/30 18:20, 5F
→
09/30 19:10, , 6F
09/30 19:10, 6F
→
09/30 19:15, , 7F
09/30 19:15, 7F
→
09/30 21:34, , 8F
09/30 21:34, 8F
→
09/30 21:34, , 9F
09/30 21:34, 9F
→
09/30 21:38, , 10F
09/30 21:38, 10F
→
09/30 21:40, , 11F
09/30 21:40, 11F
→
09/30 21:40, , 12F
09/30 21:40, 12F
→
09/30 22:33, , 13F
09/30 22:33, 13F
→
10/01 00:38, , 14F
10/01 00:38, 14F
→
10/01 00:39, , 15F
10/01 00:39, 15F
→
10/01 00:40, , 16F
10/01 00:40, 16F
→
10/01 00:41, , 17F
10/01 00:41, 17F
→
10/01 00:42, , 18F
10/01 00:42, 18F
→
10/01 00:45, , 19F
10/01 00:45, 19F
→
10/01 00:48, , 20F
10/01 00:48, 20F
→
10/01 00:50, , 21F
10/01 00:50, 21F
→
10/01 00:56, , 22F
10/01 00:56, 22F
→
10/01 02:04, , 23F
10/01 02:04, 23F
→
10/01 02:05, , 24F
10/01 02:05, 24F
→
10/01 02:06, , 25F
10/01 02:06, 25F
→
10/01 02:07, , 26F
10/01 02:07, 26F
→
10/01 02:08, , 27F
10/01 02:08, 27F
→
10/01 02:09, , 28F
10/01 02:09, 28F
推
10/04 12:13, , 29F
10/04 12:13, 29F
→
10/18 18:47, , 30F
10/18 18:47, 30F
Biotech 近期熱門文章
PTT職涯區 即時熱門文章
