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[求救] NRK52E West Blot actin飆高問題

看板Biotech (生命科學)作者 (隨欲而安)時間8年前 (2017/04/26 14:59), 編輯推噓1(1推 0噓 36→)
留言37則, 5人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
各位版友大家好，目前正在做NRK52E這株細胞做westen，在壓actin確定定量時發現，隨 著細胞代數越高，做出來的ben也越來越高...製作westen前有用elisa定量，定量結果皆 在0.995以上，想問有做這株細胞或是在做細胞westen的版友有沒有發生類似的情況？ P.S實驗室4個人所製作的結果都一樣，actin皆是最大代數的sample ben標高。 P.SS把actin改成GAPDH結果也是一樣。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 163.23.25.91 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1493189999.A.0C2.html
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04/26 16:30, , 1F
western band
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04/26 16:31, , 2F
定量結果怎麼會是0.995 那個應該是你的R square
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cell lysate定量後跑膠染個coomassie或是銀染吧 如果
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有明顯的pattern不一樣那你這個line就不適合在沒有其
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他control的情況下做不同代數間的直接比較
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謝謝修改 情急之下自創不少單字..
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04/26 16:58, , 7F
目前被要求要找出飆高的原因，究竟是在最後收細胞時發
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生問題才造成飆高還是其他原因（比如手殘、定量不準）
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04/26 17:22, , 9F
先染coomassie or ponceau S 確定總蛋白一樣多
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剛剛得知新消息...當初在收細胞時各line的濃度本來就不
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依，想請問這樣也會影響WB的band?
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04/28 16:00, , 12F
細胞濃度不一樣？啊你定量是在做功德的喔
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04/28 16:02, , 13F
幾頁前有一群文章wb control 定量 先去看完
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推
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細胞濃度是指 數量還是蛋白量呢？
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數量..
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我幫你整理一下厚，你說你收了不同代數的不同數量的
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細胞，用elisa定量後(用elisa定我也是很好奇，也沒講
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用哪隻抗體做elisa)，得到Rsquare，沒講有沒有做任何
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樣的normalisation，跑膠壓western，得到的actin不一
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樣粗。是這樣嗎？
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04/29 21:27, , 21F
他說的0.995應該是standard R^2,不是定量的OD,Elisa定量應
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該是指用multiplate reader測bradford或BCA的結果
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我也覺得是r^2啊 但是他也沒放任何的quantitation
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0.995是用標準蛋白加入96 wall後使用Elisa, OD 590下去
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跑，得出的數值計算R^2，在加入標準蛋白也會加入欲側sam
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ple。（第一次發問交代的不清楚不好意思）
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"再"加入,欲"測"
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I大說的是！是收了不同代數、不同數量的細胞，經過elisa
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標準蛋白定量後組成跑WB的sample，但是得出來的actin及G
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APDH 粗細卻不一樣。
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這個blence兄要不要處理一下
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我的想法就那些,你都說完了阿
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從原po描述用詞,有像教的學長姊只講操作流程沒教方法原理
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如果是這樣,老師應該要來解決,而不是埋頭苦做
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05/02 16:35, , 35F
謝謝B大，也講到一個重點...只有教流程沒有教原理，這
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部分會自己再和老師討論和進修！撇除流程滿多東西都是
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05/02 16:35, , 37F
自己摸索所以一知半解，謝謝
05/02 16:35, 37F
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