[求救] transformation 瘋狂爆盤TT

看板Biotech (生命科學)作者 (MIKE YU)時間8年前 (2017/04/28 10:54), 編輯推噓1(1013)
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我想請問各位大大,小弟先將要的片段PCR P出來,在gel extraction 將要用的片段弄乾 淨後,ligation 到Yeast T4DNA vector放室溫20min~30min後放到4度overnight,隔天要 做的時候,再將ligation DNA回到室溫20min~30min後在將ligation DNA加入1/3未融的DH 5a ,回插冰上30min然後放到42度heat shock 1min瞬間回插冰上5min,加入1mlLB broth, 移到37度incubator搖30分鐘,取100ul未離心先塗盤,在用3000轉5min慢速離心,將上清 液去除,留100ul 將菌團打散100ul塗盤,放37度incubator16hr,隔天取樣,plate中心皆 有藍白菌落大概20-30顆,但plate周圍都是滿滿的爆盤,做了好幾次都這樣,菌液也都有 塗乾,不知道為什麼會這樣請大家幫幫忙,還挑不到正確的菌落中 http://i.imgur.com/TOwUZit.jpg
http://i.imgur.com/OOj1gD5.jpg
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04/28 12:27, , 1F
你的問題是?這樣看起來還好啊
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04/28 12:51, , 2F
colony數量還好,外圍的問題應該是plate問題
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04/28 12:52, , 3F
敘述中沒提到任何處理,最後怎麼會有藍白菌落
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不過,如果DH5a是買來的,這樣步驟長出來的效率頗差
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04/28 15:11, , 5F
謝謝大大們指教,小弟是用(50ul LB Broth+44ul x-gal
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04/28 15:11, , 6F
+30ul ap+7ul IPTG)去塗盤在LB盤上 . DH5a我都是用CaC
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l2的方式去做處理,小弟是想問plate周圍是沒推開還是
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菌死整片,因為我幾乎推到都快推不動了
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04/28 15:33, , 9F
大部分的菌液都被推到邊邊了吧?能分享一下你塗盤的
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手法嗎
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我都將菌液滴在中間 然後左手轉盤右手拿三角啵棒順時
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鐘劃圈
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菌液是塗到乾嗎? 我不會塗乾,塗抹均勻後放烘箱自然烘
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05/05 18:36, , 14F
乾約1-2 hr,再翻面
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文章代碼(AID): #1P0gxuVk (Biotech)
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