Re: [求救] phenol-chloroform的貯存時間...

看板Biotech (生命科學)作者kaofei (phoebe)時間8年前 (2017/07/31 16:47)推噓5(5推 0噓 12→)

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想來自己update一下使用心得順便問問大家意見orz 我後來pheno-chloroform extract了三次才進到ethanol precipitation 第一個步驟是-20 overnight然後才去離心 airdry大概10分鐘內，pellet從白色變得有點半透明我就加水elute。測得濃度有點驚人 ~700 ng/ul，但OD很可怕是3.78 260/280，peak大概260稍偏280一點我們的機器無法看230。呃...我還沒往下做ivt，因為這麼高的OD從來沒見過查網路大部分討論的是過低的情形，比較少論及OD太高代表的意義有人說是RNA汙染，但是我的Sample是PCR product或plasmid切割後ligate在一起的所以這個可能性有點低如果是phenol的污染會這樣嗎？我是否需要再做一次純化比較妥當？謝謝！ ※ 引述《kaofei (phoebe)》之銘言： : 我因為某些原因需用傳統法純化ligation完的DNA : 再買新的試劑前發現實驗室有放很久很久(可能超過五年吧= =) : 的phenol-chloroform isoamyl alchohol (25:24:1) : 一直冰在四度c，棕色瓶，顏色還是純淨透明的 (有可能還沒開過) : 聽說這個試劑的萃取效率會逐漸變差 : 我看大部分的有效日期頂多到一年 : 想請問這樣還可以用嗎= =? : 今天有拿plasmid試著抽，方法大致如下 (有可以加強的麻煩指點>"<) : 100 ul DNA與試劑等體積混合均勻後 : 13000 rpm, RT離5分鐘後取水層 (沒有repeat) : 直接進酒精沉澱 : 先加0.5倍體積的 7.5M ammonium acetate然後加2.5倍體積的100%酒精 : -80三小時 : 然後15000 rpm, 4度c 30分鐘 : 之後用預冷的70%酒精wash兩次 (只有第一次有看到pellet) : air dry，用PCR grade water回溶 : 測得濃度只有原先的0.4倍，260/280只有1.5多... : 我之後純化完的DNA要用做ivt的template : 之前都用column純化，但好像量會比較少，也沒法去除endogenous RNase : 所以就被建議用傳統法抽，但目前實驗室沒人有經驗 : 所以想請問版上大大相關的問題，以及操作上要注意的地方 : 還請不吝回答orz謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.96.149 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1501490822.A.B03.html