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[求救] PCR產物大小錯誤，但質體構建成功

看板Biotech (生命科學)作者 (姆哈哈～)時間8年前 (2017/08/22 20:14), 8年前編輯推噓3(3推 0噓 25→)
留言28則, 9人參與, 最新討論串1/1
大家好，最近實驗遇到一個問題 先簡述實驗內容： 1. PCR vector and insert 2. Digest with enzyme 3. Ligation 第一步驟PCR完大小是錯誤的 預期vector大小約為4.9k bp (原始質體大小5.9k bp) 但agarose gel結果顯示卻不是如此 (如附圖) http://imgur.com/9k2QSmi
但由於PCR結果十分專一，因此我還是回收後做酶切 大小一樣比預期中的大 (如圖) http://imgur.com/5ODd62M
雖然大小未跟預期的相同 我仍然繼續往下做vector and insert ligation 最後轉化及驗證結果 是以colony PCR insert及酶切2刀確認質體大小 皆為我要的質體 (構建成功) 想問問大家是否有遇過這種狀況? 以下為我PCR的所設定的program 94C, 5 min 94C, 40 s ---- 55C, 30 s |-30 cycles 72C, 3 min ---- 72C, 10 min 第一次遇到這種狀況 想請問有沒有人知道原因？ 謝謝! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.116.168.31 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1503404096.A.AE8.html ※ 編輯: chan50515 (140.116.168.31), 08/22/2017 20:18:42
推
08/22 21:38, , 1F
vector 用PCR?沒定序過什麼都是假的
08/22 21:38, 1F
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08/22 22:06, , 2F
就像一樓說的定序完再來說成功
08/22 22:06, 2F
好的 謝謝!
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08/22 22:18, , 3F
polymerase跟膠系統都沒講啊
08/22 22:18, 3F
PCR是使用Ex-Taq
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08/22 22:20, , 4F
你insert如果有做對 colony批跟切當然都會是對的size
08/22 22:20, 4F
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08/22 22:20, , 5F
啊
08/22 22:20, 5F
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08/22 22:21, , 6F
不止要定序 你還得把整個vector都定完
08/22 22:21, 6F
好的! 謝謝你的提醒
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08/22 22:24, , 7F
Vector要PCR大概是沒RE切點,不過放30cycle太多,容易有突變
08/22 22:24, 7F
是的，因為vector與insert沒有相同切點 所以皆須PCR
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08/22 22:24, , 8F
假使沒切位,使用驗證方法有辦法排除5.9k的污染嗎？
08/22 22:24, 8F
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08/22 22:26, , 9F
至於產物偏高,使用safe-dye內染的操作是有可能出現的
08/22 22:26, 9F
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08/22 22:26, , 10F
同以上各樓，先定序確認再做吧
08/22 22:26, 10F
好 了解了 謝謝各位 ※ 編輯: chan50515 (140.116.168.31), 08/22/2017 22:40:35
推
08/23 00:56, , 11F
原始大小5.9k 產物5.9k,是把原質體的insert一起做出
08/23 00:56, 11F
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08/23 00:56, , 12F
來啦?
08/23 00:56, 12F
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08/24 01:23, , 13F
我個人其實不太建議原PO在非得使用這個 vector 的情況下這麼
08/24 01:23, 13F
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08/24 01:25, , 14F
做。我的做法會是 vector 切一切，補平，insert 平塞。之後
08/24 01:25, 14F
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08/24 01:28, , 15F
長出來的，再用 PCR 或 RE 先確定順序，再送定序。
08/24 01:28, 15F
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08/24 01:29, , 16F
如果 insert 也是切出來的，那更好了。先將 V/I 切切純化，
08/24 01:29, 16F
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08/24 01:31, , 17F
再設計引子把 V/I 連接後整個 PCR 出來，純化、餵菌、定序。
08/24 01:31, 17F
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08/24 01:32, , 18F
而後者的 PCR 酵表，建議用高規格的。此時通常只定序看切位
08/24 01:32, 18F
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08/24 20:10, , 19F
唔，趕在被打臉之前改一下我的建議做法：
08/24 20:10, 19F
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08/24 20:11, , 20F
先將 Insert PCR 出來純化，引子用含有一部分 vertor 插入位
08/24 20:11, 20F
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08/24 20:12, , 21F
附近的序列。然後以之前的insert為 primer 去對vertor做PCR
08/24 20:12, 21F
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08/24 21:14, , 22F
上面提到的應該就是two-step site-directed mutagenesis
08/24 21:14, 22F
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08/24 21:14, , 23F
http://tinyurl.com/y9fzz8bw 把insert想像成SDM的primer
08/24 21:14, 23F
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08/24 21:15, , 24F
文中提到可以1k,我自己<2k都沒問題,但3k以上就沒成功過
08/24 21:15, 24F
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08/24 21:17, , 25F
原po的方法還是有遇到的機會,不過我比較偏好重新創造MCS
08/24 21:17, 25F
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08/28 16:14, , 26F
我手上做過的 insert，確實沒有超過 2K 過。
08/28 16:14, 26F
推
09/07 04:56, , 27F
喜歡自己做 cloning site +1
09/07 04:56, 27F
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06/23 16:33, , 28F
換一家MARKER對照看看
06/23 16:33, 28F
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