Re: [求救] PCR的band神奇地消失了消失
以前的幾個同事常要做PCR-RFLP，而且也是要創造REsite的情況
我把他們出現問題的地方整理一下 (雖然有可能都跟你的狀況無關)
以我們lab來說，機器一直有不同人操作實驗
還未發生整個機器不穩定或異常造成問題，平常也有穩壓器或UPS保護
但特定well或有可能，不過整盤96well plate上機就很容易發現
若是PCR reagent的異常幾乎都是是DNA污染
這也容易在NTC發現問題，換掉整套耗材或試劑就好
所以問題都出在跑膠上
以下是遇到從有到無，但產物"一直都在"的情況
1.採用EtBr內染。
為了拉開cut/uncut的差異拉長跑膠時間，
導致EtBr過渡往負極跑，故膠體上端明亮，下端一片漆黑看不到產物
2.膠太厚，又被loading dye中的bromophenol blue的顏色蓋住影像。
使用2%測試條件時，bromophenol blue至於跟100bp左右訊號重疊
但使用3%膠時，影像更糊，又更容易卡到bromophenol blue
3.經過純化後產物不見。
因為是PCR-RFLP，所以會想clean up再切，
然而產物太小回收率差，或用太多體積回收，所以產物消失。
反之，則是有過把primer dimer在跑膠時誤認為產物的情況
由於習慣上用的parallel PCR control是GAPDH約580bp
造成上述的問題在troubleshooting時不容易被排除
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附帶一提，cycling condition應該是依照paper的吧？
如果自己開發的，調成這樣的參數似乎暗示這段產物不容易放大
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