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[求救] PCR的band神奇地消失了

看板Biotech (生命科學)作者 (靘~BI單身日記)時間8年前 (2017/09/25 13:38), 8年前編輯推噓8(8推 0噓 26→)
留言34則, 8人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
小弟正在利用PCR和Rsa I digestion的方式進行db/db mice的genotyping， 以下為primer與PCR條件 Rsa I-F (5’-AGAACGGACACTCTTTGAAGTCTC-3’) Rsa I-R (5’-CATTCAAACCATAGTTTAGGTTTGTGT-3’). 94℃for 1 min, 55℃for 1 min, 72℃for 1 min for 40 cycles. 一開始兩個月都沒問題，但卻突然在兩個星期前開始P不出任何band了， primer重訂、polymerase重買，同樣的PCR reaction在另一組lepr全長的primers做為con trol 有p出正確的band但利用新訂的Rsa I primer卻p不出任何band， 想請問版大門是否有逾過相同的問題，或是有什麼提議能解決這個問題? 感謝大家。 -- 狠多東西需要證明的原因.. 不是因為被相信..而是因為被懷疑.. 如果你深信不疑..那又何必去證明呢?? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.113.239.150 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1506317903.A.316.html
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09/25 14:44, , 1F
舊的gDNA有試過嗎？
09/25 14:44, 1F
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09/25 14:46, , 2F
抽gDNA的試劑同一批？
09/25 14:46, 2F
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09/25 14:55, , 3F
有利用之前成功過的舊gDNA當contorl，Rsa l primer一樣p不
09/25 14:55, 3F
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09/25 14:55, , 4F
出來，Lepr全長的primer就p的出來，抽gDNA的kit是不同組但
09/25 14:55, 4F
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09/25 14:55, , 5F
跑gel是有抽到gel上有band。
09/25 14:55, 5F
※ 編輯: ccjwo (114.137.92.7), 09/25/2017 14:57:17
推
09/25 15:26, , 6F
該不會機器出毛病吧…去其他家借一下機器，或是微
09/25 15:26, 6F
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09/25 15:26, , 7F
調一下annealing的溫度如何？
09/25 15:26, 7F
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09/25 17:39, , 8F
同一台機器同一組條件,lepr有p成功但Rsa I 沒有band,試過三
09/25 17:39, 8F
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09/25 17:39, , 9F
種溫度50...52...55...結果都一樣...
09/25 17:39, 9F
推
09/25 22:15, , 10F
Buffer有沒有換過阿
09/25 22:15, 10F
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09/25 22:28, , 11F
有...整個polymerase都買新的了...
09/25 22:28, 11F
※ 編輯: ccjwo (114.137.92.7), 09/25/2017 23:39:43
推
09/26 00:34, , 12F
同樣的polymerase? buffer跟dNTP有換嗎
09/26 00:34, 12F
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09/26 17:33, , 13F
同樣的polymerase所以用新的同牌buffer,我有用兩種不同牌
09/26 17:33, 13F
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09/26 17:33, , 14F
的dNTP進行PCR,一樣只有lepr primer control有成功, Rsa I
09/26 17:33, 14F
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09/26 17:33, , 15F
primer一樣沒有band
09/26 17:33, 15F
推
09/27 00:33, , 16F
哪家廠商做的primer.該不會做錯了
09/27 00:33, 16F
推
09/27 03:02, , 17F
Rsa片段是lepr的其中一段嗎？不然把p出來的lepr拿
09/27 03:02, 17F
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09/27 03:02, , 18F
去定序，再回來對Rsa primer看現在訂的能不能黏上
09/27 03:02, 18F
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09/27 03:02, , 19F
去？
09/27 03:02, 19F
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09/27 22:11, , 20F
文中提到用lepr全長的primer,應該不是lepr基因全長吧?
09/27 22:11, 20F
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09/27 22:16, , 21F
原po好像能換都換,也都有對照,或許不是PCR反應的問題?
09/27 22:16, 21F
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09/27 22:20, , 22F
例如這類PCR-RFLP需要創造切位,往往產物小,影響跑膠觀察
09/27 22:20, 22F
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09/28 10:32, , 23F
不是，我的意思是能夠p出lepr全長的control primer...是用
09/28 10:32, 23F
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09/28 10:32, , 24F
來確定整個PCR reaction並沒有問題...而Rsa l primer能p出
09/28 10:32, 24F
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09/28 10:32, , 25F
的長度為135 bp...在3% gel上可狠明顯的看到...接著我們再
09/28 10:32, 25F
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09/28 10:32, , 26F
利用Rsa l進行digestion...wt會得到135 bp的band...+/-有三
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09/28 10:32, , 27F
個band...-/-有兩個band...
09/28 10:32, 27F
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09/28 23:56, , 28F
PCR機器最近有沒有做保養或檢測，我有遇過溫度不準的
09/28 23:56, 28F
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09/28 23:57, , 29F
放正中間會p不出來的那種…
09/28 23:57, 29F
推
09/29 00:59, , 30F
試劑都沒有問題那就回到條件上面囉，從機器、溫度
09/29 00:59, 30F
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09/29 00:59, , 31F
跟primer方面著手吧，重新設計primer是否可行？
09/29 00:59, 31F
推
09/29 01:50, , 32F
135bp 72度 1分鐘太久了吧
09/29 01:50, 32F
推
09/29 01:52, , 33F
我猜你的data應該不是完全沒夾到東西
09/29 01:52, 33F
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09/29 01:53, , 34F
而是smear 所以看不到major band是嗎？
09/29 01:53, 34F
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