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[求救] 蛋白定量（已更新內容）

看板Biotech (生命科學)作者 (migu0531)時間6年前 (2018/01/26 23:46), 6年前編輯推噓21(21推 0噓 98→)
留言119則, 8人參與, 6年前最新討論串1/1
小妹待的實驗室最近卡在western blot定量的問題，事情是這樣的…… https://i.imgur.com/YAMFUkz.jpg
依照別人留下來的方式，同時用含有目標蛋白的全細胞lysate（冷凍解凍三次的方式破細 胞）和已知濃度的純化蛋白，分 別3倍連續稀釋去做western，再看呈色的條帶粗度比較相應的目標蛋白含量。 用自製的10%膠，蛋白上樣10ul，running buffer是tris-glycine，跑上膠50v 30分鐘， 下膠120v 50分鐘。transfer使用i-blot快速轉漬9分鐘，用市售的t- pro blocking buff er室溫下搖晃作用1小時，使用的是動物免疫實驗採集的血清作為一抗作用1小時（血清先 用IFA測定力價，western使用則是把測定的力價稀釋到4x IFA。例如力價IFA 2048x >> I FA 4x，western 用4ml blocking，則加7.8 ul）。二抗AP cong.是市售abcam 抗體稀釋1 000倍，室溫1小時。所有wash步驟都是每次3分鐘，共洗5次。呈色用thermo Bcip/NBT 呈 色時間都不太固定，會視背景和顯色程度，大概都是在3~5分鐘。 但不管我怎麼去調整blocking時間、一抗和 二抗的稀釋倍數，最後呈色都很髒，甚至有一圈一坨的影子。直接用手機拍照。（如圖） 小妹認為直接從動物身上分離的血清會很髒，會有很多干擾。請問還有什麼方式可降低血 清背景干擾? 另外，小妹認為western適合定性，不適合定量，所以有想到用elisa的方式。 想法是這樣……用已知的濃度的純化蛋白和目標蛋白lysate做連續稀釋進行抗原coat ing，一抗的動物血清使用固定的稀釋倍數，最後用reader讀值。將已知濃度的讀值拉標 準曲線，把未知的讀值去套用，計算出相對的蛋白量。不知道這方式是否可行? 順便問問，不走純化路線的話，還有哪些方式可以進行蛋白定量?? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.14.230.143 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1516981616.A.C38.html ※ 編輯: migu0531 (101.14.230.143), 01/26/2018 23:50:31
推
01/27 00:25, 6年前 , 1F
ELISA比較適合定量 WB抗體不好還是算了
01/27 00:25, 1F
推
01/27 01:32, 6年前 , 2F
一圈一圈的這看起來比較像transfer或western 過程不乾淨，
01/27 01:32, 2F
→
01/27 01:32, 6年前 , 3F
lysate干擾會比較像是很多雜band，不過誠如1樓所說用elisa
01/27 01:32, 3F
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01/27 01:32, 6年前 , 4F
定量會好一些
01/27 01:32, 4F
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01/27 03:21, 6年前 , 5F
你有用保鮮膜？有壓平？
01/27 03:21, 5F
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01/27 10:59, 6年前 , 6F
那elisa定量可以用我想的這方式進行嗎？有沒有需要調整
01/27 10:59, 6F
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01/27 10:59, 6年前 , 7F
的?
01/27 10:59, 7F
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01/27 11:01, 6年前 , 8F
Western wash的時間我也有拉長，但如果是transfer的問題
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01/27 11:01, 6年前 , 9F
話，會是什麼? 我都用i-blot快速轉漬。但如果做其他純
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01/27 11:01, 6年前 , 10F
化的蛋白就不會有這樣一圈一圈的現象
01/27 11:01, 10F
推
01/27 14:24, 6年前 , 11F
其實你這個方法已經足夠了，問題是你的轉印後的某個步驟
01/27 14:24, 11F
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01/27 14:24, 6年前 , 12F
有很大瑕疵，你如果是底片呈色最好在暗房確定是不是蛋白
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01/27 14:24, 6年前 , 13F
質太多或呈色劑太強，有時候太強你會看到呈色劑被催化太
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01/27 14:24, 6年前 , 14F
快，在塑膠片跟底片之間一邊擴散一邊發光。ELISA其實不
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01/27 14:24, 6年前 , 15F
會比較好，只是眼不見為淨，你要用ELISA最好要用sandwic
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01/27 14:24, 6年前 , 16F
h的方式，也就是需要兩個抗體分別抓你要檢測之蛋白質的
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01/27 14:24, 6年前 , 17F
不同端，要不然誤差比你現在的方式還大。
01/27 14:24, 17F
推
01/27 14:33, 6年前 , 18F
上面不小心打錯，是塑膠片跟膜之間。你可以把膜放到裝有
01/27 14:33, 18F
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01/27 14:33, 6年前 , 19F
呈色劑的盒子內搖一搖，然後用鎳子夾起來讓膜上的液體稍
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01/27 14:33, 6年前 , 20F
微滴乾再壓片試試。通常在暗房壓片不要急著用底片呈色，
01/27 14:33, 20F
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01/27 14:33, 6年前 , 21F
應該要先觀察冷光強度，如果肉眼都能很明顯看到，那通常
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01/27 14:33, 6年前 , 22F
代表冷光太強了，要再重新調整。
01/27 14:33, 22F
推
01/27 14:39, 6年前 , 23F
至於妳說的“直接從動物身上分離的血清會很雜，會有很多
01/27 14:39, 23F
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01/27 14:39, 6年前 , 24F
背景干擾。”其實是不存在的。因為你做的是western-blot
01/27 14:39, 24F
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01/27 14:39, 6年前 , 25F
，由於轉印前面是電泳的關係，你所謂的背景怎麼可能會一
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01/27 14:39, 6年前 , 26F
圈一圈的出現在膜上呢？
01/27 14:39, 26F
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01/27 17:59, 6年前 , 27F
加完ecl後 滴乾 背面跟角落用擦手紙吸乾 再準備壓 保
01/27 17:59, 27F
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01/27 17:59, 6年前 , 28F
險膜/塑膠片用滾輪滾過確保沒有空隙
01/27 17:59, 28F
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01/27 18:03, 6年前 , 29F
你的圖有掃過處理過吧 看不太出來原本的intensity 那
01/27 18:03, 29F
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01/27 18:03, 6年前 , 30F
個pattern也有可能是membrane/底片老化或潮到 可以壓
01/27 18:03, 30F
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01/27 18:03, 6年前 , 31F
張白片做control
01/27 18:03, 31F
→
01/27 23:24, 6年前 , 32F
我不是用壓片的方式~
01/27 23:24, 32F
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01/27 23:26, 6年前 , 33F
背景有兩的問題，一個是出現一圈或是一坨的，另一個是
01/27 23:26, 33F
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01/27 23:26, 6年前 , 34F
整張membrane背景容易黑掉
01/27 23:26, 34F
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01/27 23:29, 6年前 , 35F
01/27 23:29, 35F
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01/27 23:30, 6年前 , 36F
會像這圖一樣，連我的marker，和目標條帶都快跟北京融
01/27 23:30, 36F
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01/27 23:30, 6年前 , 37F
為一體了！
01/27 23:30, 37F
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01/27 23:30, 6年前 , 38F
背景
01/27 23:30, 38F
推
01/27 23:40, 6年前 , 39F
說實在…妳自己不講清楚沒人知道妳再幹嘛，我想應該沒人
01/27 23:40, 39F
還有 41 則推文
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01/31 12:27, 6年前 , 81F
希望這討論別引起戰爭。 我相信血清對上沒有純化的蛋白
01/31 12:27, 81F
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01/31 12:27, 6年前 , 82F
，背景會髒這件事，以前老師是這樣跟我們說。但現在實
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01/31 12:27, 6年前 , 83F
驗室認為是我操作的問題，所以上來尋求其他方式
01/31 12:27, 83F
推
01/31 12:41, 6年前 , 84F
血清容易不乾淨+1 通常是大量的IgG.albumin的干擾 可以
01/31 12:41, 84F
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01/31 12:42, 6年前 , 85F
找到相應的去除方式 甚至kit 另外妳不是用壓片的方式是
01/31 12:42, 85F
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01/31 12:43, 6年前 , 86F
指... 妳用照相儀器偵測? 還是直接染membrane? 我其實看
01/31 12:43, 86F
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01/31 12:43, 6年前 , 87F
不太出來 可以請妳說詳細一些嗎
01/31 12:43, 87F
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01/31 12:44, 6年前 , 88F
這一圈一圈的髒汙 卻沒有影響到band 我判斷不是running
01/31 12:44, 88F
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01/31 12:45, 6年前 , 89F
或transfer的問題 可能是membrane本身品質 或染抗體不勻
01/31 12:45, 89F
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01/31 12:45, 6年前 , 90F
所導致
01/31 12:45, 90F
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01/31 13:02, 6年前 , 91F
原po應該不知道問題在原本內容交代不清,推文只能用猜謎
01/31 13:02, 91F
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01/31 13:02, 6年前 , 92F
要從WB改變成ELISA,我認為至少先確認問題是WB技術瓶頸,而
01/31 13:02, 92F
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01/31 13:03, 6年前 , 93F
不是人為因素改變策略才有必要,畢竟ELISA怎說一定順遂呢?
01/31 13:03, 93F
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01/31 13:06, 6年前 , 94F
推文說不是壓片,但兩張連結不像是照相,我有誤會嗎？
01/31 13:06, 94F
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01/31 18:32, 6年前 , 95F
那個一看就不是抗體的問題
01/31 18:32, 95F
推
01/31 18:35, 6年前 , 96F
再者如果你覺得是抗體不好 你完全無法確認elisa的訊
01/31 18:35, 96F
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01/31 18:35, 6年前 , 97F
號是你的protein
01/31 18:35, 97F
※ 編輯: migu0531 (101.12.146.105), 01/31/2018 19:20:29 ※ 編輯: migu0531 (101.12.146.105), 01/31/2018 19:20:53
→
01/31 19:22, 6年前 , 98F
是用手機照相的
01/31 19:22, 98F
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01/31 19:59, 6年前 , 99F
另外，只有在做這全蛋白的western才會有這樣的現象。其
01/31 19:59, 99F
→
01/31 19:59, 6年前 , 100F
他純化的蛋白用市售的抗體則不會這樣
01/31 19:59, 100F
→
01/31 20:06, 6年前 , 101F
你看推文應該會覺得不少人誤解呈色方法,那時就該介入澄清
01/31 20:06, 101F
推
01/31 20:45, 6年前 , 102F
她自己可能也不了解自己的實驗在做什麼，或跟其他實驗室
01/31 20:45, 102F
→
01/31 20:45, 6年前 , 103F
有什麼不同，但我猜這照片應該不是最常被使用的冷光底片
01/31 20:45, 103F
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01/31 20:45, 6年前 , 104F
呈色，而是用NBT 之類的試劑直接在膜上呈色，所以照片裡
01/31 20:45, 104F
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01/31 20:45, 6年前 , 105F
的圖才不像是底片透明的，那些一坨一坨的背景是色素沉澱
01/31 20:45, 105F
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01/31 20:45, 6年前 , 106F
在膜上。
01/31 20:45, 106F
推
01/31 20:55, 6年前 , 107F
我回覆完才看到原po修改的內容了，剛樓上打的就當作是多
01/31 20:55, 107F
→
01/31 20:55, 6年前 , 108F
餘的吧。
01/31 20:55, 108F
推
01/31 21:05, 6年前 , 109F
妳打清楚後答案就很明顯了。問題很有可能來自你使用的一
01/31 21:05, 109F
→
01/31 21:05, 6年前 , 110F
抗是自製的動物血清，還有你用的blocking試劑。簡單來說
01/31 21:05, 110F
→
01/31 21:05, 6年前 , 111F
一抗最好越純越好(用自製的以後發表時麻煩會多許多)，而
01/31 21:05, 111F
→
01/31 21:05, 6年前 , 112F
blocking試劑不是用commercial就一定沒問題。當然NBT這
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01/31 21:05, 6年前 , 113F
個方法背景值比冷光呈色高也可能使你的問題更嚴重。
01/31 21:05, 113F
推
01/31 22:37, 6年前 , 114F
只能說抗體不好, 做什麼都不會順遂....
01/31 22:37, 114F
→
01/31 22:37, 6年前 , 115F
若是時間財力允許, 進一步純化抗體會比較好
01/31 22:37, 115F
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02/01 00:19, 6年前 , 116F
建議換呈色方法
02/01 00:19, 116F
→
02/01 00:36, 6年前 , 117F
改用冷光呈色(CDP-STAR之類) 然後再來修正blocking 抗
02/01 00:36, 117F
→
02/01 00:36, 6年前 , 118F
體等條件 我會先選擇1抗改成4度C 搖o/n 再來修正blocking
02/01 00:36, 118F
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02/01 00:36, 6年前 , 119F
buffer(濃度 種類) 都不行我就會說1抗不優不好用T.T
02/01 00:36, 119F
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