Re: [求救] 基轉後農桿菌無法根除

看板Biotech (生命科學)作者AuroraSky (長煙一空皓月千里)時間7年前 (2018/02/03 14:39)推噓1(1推 0噓 0→)

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※ 引述《stephilow ()》之銘言： : 想請問一下， : 我做植物的基因轉殖， : 是用農桿菌感染的轉殖方式。 : 植物材料是桉樹跟菸草無菌苗的葉片。 : 感染後兩天葉片周圍會長出細菌， : 我加入cefataxin和carbcillin清洗後， : 發覺菌量會暴增，之後怎麼洗也很清除乾菌。 : 最後是菌量過多掩蓋葉片，然後葉片就爛掉死了... 菌量蓋過葉片就沒救了 : 請問有甚麼方法可以解決?(做了一年都沒成果) : 如果是菌種汙染，有甚麼方法可以可以解決? 除非你很不幸又很衰被抗cefotaxim的菌汙染到，不然聽起來比較像是葉片沒洗乾淨。 (你轉進去的construct應該沒帶抗cefotaxim基因吧) : 謝謝不知道現在回會不會太晚。不知道你是怎麼清洗的，我有聽過有人洗葉片是輕輕把葉片在無菌水上刷幾回，好像涮涮鍋一樣，結果當然菌一直長 XD 以下是從前實驗室的韓國博後學來的，我自己獨立做菸草轉基因，基本上都有一定的成功率。一樣也是感染後48小時把葉片拿出來洗，每一組準備約350 ml的無菌ddH2O (dH2O應該也可) 另外準備乾淨滅過菌的250 ml錐形瓶， (所以要事前把錐形瓶蓋鋁箔封口，滅菌，放涼) 把葉片從培養基拿出來，放進錐形瓶，倒入約100ml無菌水，用力搖晃或是vortex十多秒後水變混濁，倒掉， (請善用你的鑷子把葉片留在瓶口) 接著再倒入100ml無菌水，重複用力搖晃或是vortex十多秒後水變混濁，倒掉，接著再倒入100ml無菌水，一樣搖晃後倒掉，理論上第三次的水應該相當清澈。把葉子取出，放到無菌的濾紙或無菌擦手紙上晾乾，接著再把葉子放置於regeneration medium. Regeneration medium放cefotaxim 是必備，不知道你培養基cefotaxim放多少，我看過有人放250 mg/L, 也有人放500 mg/L, 我自己比較常放500 mg/L，毒不死菸草的，你也可以試試看。另外切記cefotaxim的作用更接近抑制菌的生長，而非殺菌，加上抗生素活性會隨時間衰減，請記得每3-4週就要換一次培養基，最好每次培養基都加cefotaxim, 直到長出來的小苗移進土壤為止。 (這也是為什麼有些人認為轉基因菸草丟棄前應該整株Autoclave) 另外regeneration如果有那麼一片leaflet有農桿菌長出來，請果斷把那片leaflet及周圍培養基一併挖除，像切除腫瘤一樣。以上希望有幫到你，有問題歡迎回文。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 68.203.70.186 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1517639992.A.039.html