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[求救] H1299肺癌細胞養不起來

看板Biotech (生命科學)作者 (珼珼)時間7年前 (2018/05/03 23:44), 7年前編輯推噓14(14推 0噓 33→)
留言47則, 13人參與, 7年前最新討論串1/2 (看更多)
大家好 目前解凍後的H1299肺癌細胞 一直養的不是很理想 這邊列出步驟跟細胞的狀況 想知道問題到底出在哪裡 使用的medium 是 DMEM+sodium pyruvate 步驟 1.細胞從液態氮取出後立即解凍直接放進medium 中 medium 我大概是用10-15cc在dish 2.確認一下有均勻分布後就直接放進培養箱 3.隔天會換medium 大約7-8cc （會用PBS清洗） 細胞狀況 1.貼壁的情況不是很好，有很多細胞會飄起來。 2.本以為是可能原本細胞凍太稀，所以後來是用 6公分的dish把細胞液分兩盤養，medium 是4-5cc,再加0.5cc細胞液，但情況差不多，有貼但也很飄，可是medium 沒有變色也沒有混濁。 6公分的dish把細胞液分兩盤養，medium 是4-5cc,再加0.5cc細胞液，但情況差不多，有貼但也很飄，可是medium 沒有變色也沒有混濁。 3.解凍的隔天我會看一下細胞的狀況，但常常看到有一點一點的黑色碎屑在細胞旁邊，不太確定是什麼東西，仔細看會感覺有在跳動，晃動dish的時候碎屑不太會移動。 4.H1299聽學姊描述是會展開有點像神經細胞的樣子，會有角的，我解的細胞有展開但很多都是圓圓的，但不是全部都會飄。 之前解凍第一管沒長好 我後來看medium中有白色的漂浮物 所以有換過medium 解第二管的時候情況也沒有好轉 所以我覺得不是medium的問題 （我有test新的medium 但沒有長東西） 可是每次隔天看細胞都還是有黑色碎屑 我不確定是污染還是寄生蟲 或是只是代謝物 手法的部分，我覺得我滿輕巧的 都是吸出後直接加進medium 裡 而且還是輕輕的注入 如果是凍管本身的問題我該如何處理好呢 我已經解了大概4管都長不起來 我已經解了大概4管都長不起來 我也不太動他怕他長不好 大概兩天看一次 學姊說他之前有養成功 讓我更挫折 我找不到原因在哪裡害我很慌張 我有養另一株肺癌細胞A549 這株學姊說比較好養叫我先做這株 養的也蠻順利的已經culture 很多代了 但對H1299始終沒有辦法 請大家救救我感謝大家 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 110.50.175.86 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1525362258.A.EDB.html
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05/04 00:11, 7年前 , 1F
DMSO 有洗掉嗎？
05/04 00:11, 1F
推
05/04 00:12, 7年前 , 2F
聽起來是凍壞或污染？ 後者不太有救…
05/04 00:12, 2F
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05/04 00:13, 7年前 , 3F
血清是哪個等級的?
05/04 00:13, 3F
推
05/04 02:09, 7年前 , 4F
或許是凍壞，碎屑可能是死細胞碎片，會影響細胞生
05/04 02:09, 4F
推
05/04 02:09, 7年前 , 5F
或許是凍壞，碎屑可能是死細胞碎片，會影響細胞生
05/04 02:09, 5F
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05/04 02:09, 7年前 , 6F
長，如果有部分貼附可以考慮置換medium，等到細胞
05/04 02:09, 6F
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05/04 02:09, 7年前 , 7F
群長起來再打散繼代
05/04 02:09, 7F
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05/04 10:49, 7年前 , 8F
Medium回溶以後會離心去DMSO 再丟進去dish 隔天再換一次
05/04 10:49, 8F
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05/04 10:49, 7年前 , 9F
medium 確保DMSO移除
05/04 10:49, 9F
推
05/04 16:44, 7年前 , 10F
我之前解凍DMSO沒有移除，H1299照樣長，也許不是這個問題
05/04 16:44, 10F
推
05/04 16:45, 7年前 , 11F
聽起來比較想凍壞耶 凍在哪凍多久?
05/04 16:45, 11F
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05/04 16:46, 7年前 , 12F
*像 個人也是養A549跟H1299 這兩株應該都算是生命
05/04 16:46, 12F
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05/04 16:46, 7年前 , 13F
力強又好養也不太漂的
05/04 16:46, 13F
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05/05 00:41, 7年前 , 14F
你們H1299是用DMEM養？我以前是用RPMI1640養，不曉得有
05/05 00:41, 14F
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05/05 00:41, 7年前 , 15F
沒有差？
05/05 00:41, 15F
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05/05 00:43, 7年前 , 16F
不過如果實驗室長期以來用DMEM養都OK，有沒有可能是凍
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05/05 00:43, 7年前 , 17F
壞了呢？
05/05 00:43, 17F
推
05/05 15:32, 7年前 , 18F
我能借題 問一下 什麼是凍壞了?
05/05 15:32, 18F
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05/05 15:32, 7年前 , 19F
是指凍細胞的流程出問題?還是細胞保存的過程有問題?
05/05 15:32, 19F
推
05/05 16:25, 7年前 , 20F
樓上說的都有可能； 凍的時候降溫過快，回溫解凍不夠
05/05 16:25, 20F
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05/05 16:25, 7年前 , 21F
快，加入的 DMSO不足量等等
05/05 16:25, 21F
05/05 16:25 先感謝各位的回覆，我沒有洗掉DMSO，我是直接加入medium隔天再用DPBS洗，然後換新的medium。 細胞是凍在液態氮裡是2017/07/26凍的，同一桶裡的細胞學姊也常在解凍其他細胞，應該不是液態氮桶的問題...嗎？ 凍管是大學姊凍的，我上一屆的學姊有說他覺得H1299比A549難養，可是大學姊跟我上一屆學姊說他們養的起來嗚嗚嗚，我覺得好挫折。 這邊想問一下各位大大，如果先離心去除DMSO的話會比較好嗎？這個步驟會算是回溫不夠快嗎，我一直不敢嘗試，因為大家都建議要1分鐘內回溫。 ※ 編輯: zzxc87520 (110.50.175.86), 05/06/2018 00:56:04
推
05/06 10:59, 7年前 , 22F
放37度水浴槽到凍管快溶即可;後離1000rpm 3min，吸去
05/06 10:59, 22F
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05/06 10:59, 7年前 , 23F
上清回溶到 medium裡。
05/06 10:59, 23F
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05/06 11:00, 7年前 , 24F
有時候沒離掉細胞飄很慘@@
05/06 11:00, 24F
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05/06 15:54, 7年前 , 25F
classroom.bcrc.firdi.org.tw/home/cell/cell_thrawing
05/06 15:54, 25F
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05/06 15:54, 7年前 , 26F
除非體積太少,冷凍細胞在1分鐘內就回溶比BCRC預估時間還快
05/06 15:54, 26F
推
05/06 15:56, 7年前 , 27F
自己做的時候1mL實際回溶時間大概在1~2min左右
05/06 15:56, 27F
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05/06 15:56, 7年前 , 28F
多數癌細胞也不需回溶時除去DMSO,隔天換medium還比較好
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05/07 07:48, 7年前 , 29F
之前養1299跟A549都覺得很好養，不過我也是用PRMI
05/07 07:48, 29F
推
05/07 10:22, 7年前 , 30F
凍壞了 看有沒有更早之前的passage
05/07 10:22, 30F
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05/07 10:23, 7年前 , 31F
我之前有養過MDCK 發生過一樣的事情 但我的細胞會長
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05/07 10:23, 7年前 , 32F
長得比之前的慢 黑色碎片會變多
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05/07 10:23, 7年前 , 33F
換早期一點的代數重新解凍養就行了
05/07 10:23, 33F
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05/10 00:30, 7年前 , 34F
抱歉 同為H1299有問題想借串發問請教培養經驗
05/10 00:30, 34F
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05/10 00:31, 7年前 , 35F
我在Trypsinize時會放incubator 每2 3分鐘會輕拍然後
05/10 00:31, 35F
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05/10 00:32, 7年前 , 36F
觀察 但是發現常常細胞雖然已經全部都有飄起來 但都
05/10 00:32, 36F
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05/10 00:32, 7年前 , 37F
會有小小聚成團的方式 離心打散pellet種下去還是會有
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05/10 00:33, 7年前 , 38F
想請問有人有沒有解決的經驗或建議的解決方式 感謝!
05/10 00:33, 38F
推
05/12 11:52, 7年前 , 39F
有沒有可能是打得不夠散？先以1-2mL打散均勻之後再種看
05/12 11:52, 39F
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05/12 11:52, 7年前 , 40F
看呢
05/12 11:52, 40F
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05/12 12:13, 7年前 , 41F
我都是用1ml的medium打散 但感覺還是會稍微有點小團
05/12 12:13, 41F
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05/12 12:13, 7年前 , 42F
才想說有沒有其他的選項可以嘗試XD
05/12 12:13, 42F
推
05/12 13:52, 7年前 , 43F
在pellet的時候可以先敲散 然後再加medium打散
05/12 13:52, 43F
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05/12 16:26, 7年前 , 44F
這招我倒是沒想到 謝謝建議!XD
05/12 16:26, 44F
推
05/25 07:50, 7年前 , 45F
medium 先回溫到37度，加到盤子裡。
05/25 07:50, 45F
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05/25 07:52, 7年前 , 46F
細胞凍管迅速回溫，然後滴入medium
05/25 07:52, 46F
推
05/25 07:54, 7年前 , 47F
過8小時去搖搖盤子看貼了沒，貼了之後立刻換medium，
05/25 07:54, 47F
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