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Re: [求救] 細胞打散後放一陣子後嚴重成團無法解決

看板Biotech (生命科學)作者 ( )時間6年前 (2018/11/20 04:44), 6年前編輯推噓3(3推 0噓 9→)
留言12則, 2人參與, 6年前最新討論串2/2 (看更多)
※ 引述《steve42125 (Shiburin)》之銘言： : 實驗步驟是這樣的 : 以0.5ml trypsin-EDTA消化大約3min之後以1.5ml medium中和 : 離心1250rpm, 5mins後去除上清以適當比例打散 : 打散的方法是會先用200ul pipette打大概30次 : 再以1ml pipette取1ml medium再打大約20次之後依pellet大小稀釋進行細胞記數 細胞被打散，被離心，又被打散，應該很痛苦吧 當你[以1.5ml medium中和時]， 1.確認當時細胞已經一顆顆分離 2.就可以取10ul計數，剩下的細胞有需要再去離心 3.計數完算好用量，剛好離心完可以分盤安排實驗 這樣就很順利了阿 而且你的離心時間也比我的多一倍，打散的細胞也會黏得更緊密 Counting chamber的設計應該不會一團沒打散的細胞跑進去 用這個來判斷有沒有散開，比用dish直接看還不準確 已經分散開的細胞，就算手勢在怎麼搖，甚至不搖 也只會影響細胞在dish的分佈有沒有均勻 不覺得會讓細胞5~10分鐘內團塊聚集 另外，你每個步驟流程耗費時間跟熟悉度 分三個clone操作是應該的 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.218.151.4 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1542660260.A.AAA.html
推
11/20 08:19, 6年前 , 1F
謝謝大大額外回一篇來幫我解說！有幾個小問題想要請問
11/20 08:19, 1F
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11/20 08:20, 6年前 , 2F
想請問你離細胞的轉速跟時間通常用多久?
11/20 08:20, 2F
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11/20 08:20, 6年前 , 3F
想說降到1000 rpm, 3 mins 不知道夠不夠
11/20 08:20, 3F
我沒有提到降轉速阿
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11/20 08:21, 6年前 , 4F
第二個問題是如果數完離心在打散 不會因為離心lost掉
11/20 08:21, 4F
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11/20 08:21, 6年前 , 5F
細胞而使得細胞數不準確嗎?
11/20 08:21, 5F
如果細胞計數會明顯差異，顯然是有些細胞離心不下來 也就是不少死亡或狀況不佳的細胞，那應該去改善你的culture流程
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11/20 08:21, 6年前 , 6F
最後是你說的分三個clone是指說一次消化一個Clone
11/20 08:21, 6F
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11/20 08:22, 6年前 , 7F
全部消化好計算好之後再開始分盤做實驗?
11/20 08:22, 7F
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11/20 08:23, 6年前 , 8F
還是說一次消化一盤做好一個Clone的ABC實驗分盤 再
11/20 08:23, 8F
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11/20 08:23, 6年前 , 9F
再做下個實驗？ 不好意思問題有點多 再麻煩您的建議！
11/20 08:23, 9F
推
11/20 09:24, 6年前 , 10F
b 大應該是建議後者 三盤當三個實驗做
11/20 09:24, 10F
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11/20 09:25, 6年前 , 11F
目前的轉速應該沒問題
11/20 09:25, 11F
嗯，沒錯是後者 從PBS wash開始到細胞放回去養，時間越短越好 ※ 編輯: blence (140.109.40.29), 11/20/2018 11:35:49
推
11/20 11:58, 6年前 , 12F
了解了！ 謝謝B大 我會試試看你的建議 謝謝你！
11/20 11:58, 12F
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