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[求救] ligation 測濃度 dsdna 濃度超高OAO

看板Biotech (生命科學)作者 (點點)時間6年前 (2019/01/22 18:56), 6年前編輯推噓3(3推 0噓 88→)
留言91則, 10人參與, 5年前最新討論串1/1
準備ligation之前測濃度 看的是雙股DNA那個部分，有對照組，也有放blank，對照組是15.16，表示這項測驗可相信，但！！我測出來的是 Insert : 709.35 Vector : 696.78 請問有大大有遇過超高標的mass嗎ノ( ' - 'ノ) ————————————— 1. 260/280的值是15-19之間，對照組是1.多～ 2. Insert 是病毒片段，準備做chimeric virus -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.117.157 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1548154603.A.941.html ※ 編輯: yiimingg (140.120.117.157), 01/22/2019 18:57:45 ※ 編輯: yiimingg (140.120.117.157), 01/22/2019 18:58:16 ※ 編輯: yiimingg (140.120.117.157), 01/22/2019 18:58:30
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01/22 19:06, 6年前 , 1F
稀釋一下跑個膠啊...
01/22 19:06, 1F
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01/22 19:07, 6年前 , 2F
雖然好像應該先看一下260/280的比值
01/22 19:07, 2F
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01/22 20:59, 6年前 , 3F
我猜你的 DNA 是 phenol-chroloform 萃取的吧
01/22 20:59, 3F
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01/22 21:00, 6年前 , 4F
phenol-chroloform 萃取的 DNA 常常沒辦法用吸光值定量
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01/22 21:01, 6年前 , 5F
，不知道為什麼數值都會飆超高，用 gel extraction/PCR
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01/22 21:01, 6年前 , 6F
clean-up kit 純化的就不會有這個問題
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推
01/22 22:44, 6年前 , 7F
跑膠定量吧
01/22 22:44, 7F
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01/23 00:52, 6年前 , 8F
是病毒和載體XD 準備做chimeric virus，關於跑膠定量我
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01/23 00:52, 6年前 , 9F
是病毒和載體XD 準備做chimeric virus，關於跑膠定量我
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01/23 00:52, 6年前 , 10F
明天會再查資料嘗試看看，感謝大大們( ‧ 蹏s‧? )
01/23 00:52, 10F
※ 編輯: yiimingg (114.46.128.202), 01/23/2019 00:55:16
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01/23 09:50, 6年前 , 11F
DNA測 260/280一般只會小於1.8 , 15-19一定殘留很多東西
01/23 09:50, 11F
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01/23 11:04, 6年前 , 12F
我是分別digestion 的，用Ecor1 和Bgl2 一個是2.1 buff
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01/23 11:04, 6年前 , 13F
er，另外一個是 3.1 buffer，digestion 後都有跑膠看大
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01/23 11:04, 6年前 , 14F
小，都坐落在合理的位置，做了一學期都搞不出來QQ 請問
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01/23 11:04, 6年前 , 15F
digestion 後還有什麼方式可以確認大小嗎？
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01/24 00:38, 6年前 , 16F
切膠怎麼做的 純化後有跑膠嗎
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01/24 12:41, 6年前 , 17F
我是分別digestion 2次，第一次O/N 後沒有跑膠，直接用
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01/24 12:41, 6年前 , 18F
EB 洗出來，第二次digestion 後才跑膠的
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01/24 19:57, 6年前 , 19F
有濃度了,你切多少ug,elute多少ul,算一下就可以知道的答案
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01/24 19:59, 6年前 , 20F
你們上頭的leader怎麼放任這樣的實驗拖了一學期阿
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01/24 22:17, 6年前 , 21F
分別切兩次？為何？
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01/24 22:18, 6年前 , 22F
然後EB是什麼?
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01/24 23:28, 6年前 , 23F
你怎麼純化的？一開始就問了好像都沒回答
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01/24 23:28, 6年前 , 24F
然後濃度怎麼測的 spec還是nanodrop
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01/25 11:33, 6年前 , 25F
但考慮到發文求救所digestion 出來的產物不可用，我就
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01/25 11:33, 6年前 , 26F
再digestion 一次，昨天得出來的值是Insert : 260/280:
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01/25 11:33, 6年前 , 27F
1.37, 4.8ng/ulVector : 260/280: 1.81, 67.94ng/ul
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我就分別用 1:3 和1:7 的比例去ligation
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01/25 11:33, 6年前 , 29F
EB 就是elute buffer
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01/25 11:35, 6年前 , 30F
是因為所使用的酵素buffer 分別是 Buffer 2.1 和 Buffe
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01/25 11:35, 6年前 , 31F
r 3.1，所以分兩次切
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01/25 11:37, 6年前 , 32F
至於上頭為何放任，我想這是實驗室第一次做 chimeric v
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01/25 11:37, 6年前 , 33F
irus，所以上頭也放手讓我自己嘗試找答案OAO
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01/25 11:40, 6年前 , 34F
請問妳是說什麼程序後的純化ㄋ？
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01/25 15:01, 6年前 , 35F
這是實驗室第一次做virus相關的plasmid嗎?
01/25 15:01, 35F
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01/25 16:01, 6年前 , 36F
請問這和我求救的點有相關性嗎？QQ
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01/25 18:20, 6年前 , 37F
因為virus相關的plasmid不能用一般的competent cell
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01/25 18:26, 6年前 , 38F
卡了一個學期應該不只是ligation這邊有問題
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01/25 18:27, 6年前 , 39F
應該也有挑不到對的菌，甚至菌根本沒有長這幾個狀況
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01/25 20:04, 6年前 , 40F
單從cloning角度來看，能夠double digest就絕對不要
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分開做，只要多一個步驟就是會掉產量。再加上你中間過
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column(我猜的，你也沒講)跟後面切膠(也是猜的，你沒
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講)都是回收很容易很慘的地方。要提高產量無他，增加
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反應物的量，減少步驟。nanodrop(我猜的，你沒講)讀
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值10ng/ul以下基本上跟noise分不出來，我可以跟你說你
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insert裡面大概都是水。
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01/25 20:11, 6年前 , 47F
再來一點elution buffer(哪個牌子的什麼kit都不講)這
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01/25 20:11, 6年前 , 48F
種東西通常是Tris EDTA，意思是你的第二支RE如果需要2
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+ cation，你那個rxn就等於白跑了
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01/26 09:07, 6年前 , 50F
原來芽～ 我是用DH5a！我的內容是要連續接4種insert 進
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01/26 09:07, 6年前 , 51F
去一個 vector裡面，前面的2種insert 學姐都是用DH5a，
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換我接手，是要接進去第3種insert～
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我得到的insert 和 vector 都有被定序過
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01/26 09:11, 6年前 , 54F
一個是buffer 2.1 一個是buffer 3.1，所以我才分開dige
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01/26 09:11, 6年前 , 55F
stion，請問，是否有方法可以一起digestion 嗎？（尋求
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01/26 09:11, 6年前 , 56F
更好的解決方案
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01/26 09:14, 6年前 , 57F
第一次digestion 後沒有跑膠，單純用kit 洗出來，就因
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01/26 09:14, 6年前 , 58F
為怕回收率太低
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推
01/26 10:15, 6年前 , 59F
第一次回收完只要 clean up 就好；同樓上幾位， nanod
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01/26 10:15, 6年前 , 60F
rop在這情況下的值我覺得都高估很多，建議跑膠或估算
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01/26 10:15, 6年前 , 61F
都比較準
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01/26 12:31, 6年前 , 62F
第一次digestion 後，我就只是clean up 然後elute 出來
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01/26 12:31, 6年前 , 63F
，第二次才跑膠
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01/28 01:17, 6年前 , 64F
我懷念以前的 Buffer，Buffer 3 可供 EcoRI/BglII 共切。
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01/28 06:16, 6年前 , 65F
01/28 06:16, 65F
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01/28 06:16, 6年前 , 66F
3.1還是可以一起切
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01/28 06:18, 6年前 , 67F
個人偏好可以用ethanol precipitation就不要過column/
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01/28 06:18, 6年前 , 68F
beads 回收率一定比較低
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01/28 06:20, 6年前 , 69F
為什麼會實驗室沒人帶做cloning 連double digest都沒
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01/28 06:20, 6年前 , 70F
教
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01/28 17:32, 5年前 , 71F
NEBuffer N 和 N.1 我記得只差在 N.1 通通加了 BSA
01/28 17:32, 71F
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01/28 21:56, 5年前 , 72F
要接多insert，可試試Gibson Assembly
01/28 21:56, 72F
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01/29 07:08, 5年前 , 73F
連RE都沒人帶了你要他試gibson 樓上別鬧了
01/29 07:08, 73F
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01/29 08:51, 5年前 , 74F
RE現在不都同一種buffer了，我都用Thermo的FastDigest系列
01/29 08:51, 74F
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01/29 08:54, 5年前 , 75F
NEB的話HF系列也都配Cutsmart buffet，但HF較貴，Thermo便
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01/29 08:54, 5年前 , 76F
宜多了
01/29 08:54, 76F
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01/29 08:59, 5年前 , 77F
Gibson與傳統方法相較下，效率高多了，insert不需切，vect
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01/29 08:59, 5年前 , 78F
or可用切的或PCR成線性化
01/29 08:59, 78F
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01/30 12:49, 5年前 , 79F
個人不會建議實驗卡一個學期的學生從換廠牌下手
01/30 12:49, 79F
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01/30 12:50, 5年前 , 80F
再卡一個學期的機會比做出來還大…
01/30 12:50, 80F
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01/30 16:00, 5年前 , 81F
我看到您推薦的網址惹！結果我就是用NEB家的酵素，但是
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01/30 16:00, 5年前 , 82F
我會分開切是因為之前有去對比過Ecor1 用buffer 2.1的
01/30 16:00, 82F
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01/30 16:00, 5年前 , 83F
酵素活性100* 但是用buffer 3.1只有50～ 但這次再做不
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01/30 16:00, 5年前 , 84F
出的話，一起切也是個好方法^^
01/30 16:00, 84F
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01/30 16:04, 5年前 , 85F
也不是沒人教，老師有教過跑整套cPCR 現在又換了不一樣
01/30 16:04, 85F
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01/30 16:04, 5年前 , 86F
的DNA，不一樣的product，條件我還是要自己抓啊……
01/30 16:04, 86F
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01/31 08:58, 5年前 , 87F
兩隻一起切 切20ug+ o/n 然後全部切膠純化 這是過去10
01/31 08:58, 87F
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01/31 08:59, 5年前 , 88F
年都在做cloning的人給的意見 聽不聽隨你 反正不是我
01/31 08:59, 88F
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01/31 08:59, 5年前 , 89F
要畢業
01/31 08:59, 89F
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01/31 12:24, 5年前 , 90F
謝謝 :)
01/31 12:24, 90F
推
02/26 19:15, 5年前 , 91F
中間沒細看，推分開切。有仔細研究過buffer的效率就知
02/26 19:15, 91F
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