[求救] HEK293T IFA 問題及改善方法
(手機排版)
嗚嗚嗚嗚嗚嗚嗚嗚
先感謝點進來的大大們
小妹壓力爆棚快往生了
老闆一直覺得為啥核比較大顆 (??)
為什麼沒辦法染出mitochondira 均勻分佈在細胞的樣子，老闆說要看到均勻分佈的美圖呀QQ
本lab目前沒有存在做過的人，小妹我也是自己摸索試看看，無人能討論故求板上大神們解救一下嗚嗚
以下為小妹做的方式
免疫螢光染色
1. 種細胞
取2.5 ×105 cell/well transfected 好的HEK293T cell 種於24mm圓玻片上培養16小時，去除上清液，wash PBS 2次，加入混有200nM Mitotracker的medium 培養40分鐘
2. 固定細胞
以medium 混好的3.7% Paraformaldehyde 固定細胞 15 min 後wash PBS 兩次
3. 細胞打洞
配置pernibilization buffer : 0.25% Triton X-100 加入Well內5 min
4. Blocking
配置blocking buffer 1% BSA，以最低rpm於常溫搖晃1小時，
再用PBS buffer wash 3次
5. 加入1o Ab (1:250) 作用O/N 隔天用PBS wash 2次
6. 加入2o Ab Goat anti-rabbit 488 (1:250)
以最低rpm搖1小時，再用PBS wash 2次
7. 取出玻片滴上含有DAPI封片膠後蓋於載玻片上周圍塗上指甲油固定封片
然後使用Confocal (ZEISS LSM700) 拍的
我有乖乖做Z-stack QAQ...
每次做到加triton時細胞都給我飄起來說hello..
(改0.1%也是)
我已經非常非常非常小心的加任何試劑了QQ…
我要怎麼做出細胞貼的好好，然後mitochondira均勻分佈的美圖咧QAQ
大大們可以幫小妹做個檢討嗎TAT
以下圖檔:
紅色：Mitotracker
>>MitoTracker™ Red CMXRos (Thermo)
綠色：目標protein
藍色：DAPI
http://i.imgur.com/zDygmBc.jpg
謝謝!!!!!!!!
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