Re: [求救] HEK293T IFA 問題及改善方法

看板Biotech (生命科學)作者joseph103331 (小黃加大黃)時間5年前 (2019/03/23 02:28)推噓4(4推 0噓 7→)

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※ 引述《IFN113 (CY)》之銘言： : (手機排版) : 嗚嗚嗚嗚嗚嗚嗚嗚 : 先感謝點進來的大大們 : 小妹壓力爆棚快往生了 : 老闆一直覺得為啥核比較大顆 (??) : 為什麼沒辦法染出mitochondira 均勻分佈在細胞的樣子，老闆說要看到均勻分佈的美圖呀QQ : 本lab目前沒有存在做過的人，小妹我也是自己摸索試看看，無人能討論故求板上大神們解救一下嗚嗚 : 以下為小妹做的方式 : 免疫螢光染色 : 1. 種細胞 : 取2.5 ×105 cell/well transfected 好的HEK293T cell 種於24mm圓玻片上培養16小時，去除上清液，wash PBS 2次，加入混有200nM Mitotracker的medium 培養40分鐘如同推文所說,其實HEK293 or HEK293T的貼附力普通偏爛,將Polylysine稀釋至0.01%後過濾,之後滴在玻片上室溫反應15分鐘吸掉,再用PBS快速洗過兩次就可以種細胞你的結果裡看到的DAPI形狀是正常的,表示細胞並沒有因為滲透壓皺縮很多,細胞核比例增大的原因是細胞沒貼附好,要觀察你固定前的細胞狀態才知道變圓是一開始就造成還是後續步驟的影響另外在使用mitotracker時用PBS wash的步驟是多餘的,直接換成含mitotracker的培養基就可以,我們lab使用的經驗是超過30分鐘就會出現染劑沉積,染15分鐘左右即可 Mitotracker染得好不好可以先在螢光顯微鏡下面檢查,太淡可以加時間,太深趕快拿起來 : 2. 固定細胞 : 以medium 混好的3.7% Paraformaldehyde 固定細胞 15 min 後wash PBS 兩次這裡有問題,PFA固定液主要作用在蛋白質的氨基,先不論medium是否有血清,medium的成分已經有胺基酸,肯定會破壞固定液的效果,後續會飄起來的原因應該是這個一般在沒有coating的玻片上操作,固定的步驟就會讓很多細胞掉下來,有coating的話就會改善很多,細胞形狀也較佳固定完以後除非去刮或是直接沖洗玻片才有可能讓細胞掉下來,照理來講這步之後就不用太小心加試劑,如果細胞還是有飄的狀況大多是固定出問題 : 3. 細胞打洞 : 配置pernibilization buffer : 0.25% Triton X-100 加入Well內5 min : 4. Blocking : 配置blocking buffer 1% BSA，以最低rpm於常溫搖晃1小時， : 再用PBS buffer wash 3次 : 5. 加入1o Ab (1:250) 作用O/N 隔天用PBS wash 2次 : 6. 加入2o Ab Goat anti-rabbit 488 (1:250) : 以最低rpm搖1小時，再用PBS wash 2次 : 7. 取出玻片滴上含有DAPI封片膠後蓋於載玻片上周圍塗上指甲油固定封片 : 然後使用Confocal (ZEISS LSM700) 拍的 : 我有乖乖做Z-stack QAQ... Z-stack並不是必須的,除非你要疊圖或是靠疊圖增加訊號,不然單層照片理論上就足夠說明蛋白質的位置啦,Z-stack照一張要8-10min,單層的只要幾秒鐘而已XD : 每次做到加triton時細胞都給我飄起來說hello.. : (改0.1%也是) : 我已經非常非常非常小心的加任何試劑了QQ… : 我要怎麼做出細胞貼的好好，然後mitochondira均勻分佈的美圖咧QAQ : 大大們可以幫小妹做個檢討嗎TAT Permeable跟抗體反應你的圖都有訊號,所以條件可能OK 只是我有幾個疑問配製溶液的基底都是PBS吧? Permeable到blocking中間沒有洗嗎? blocking到1抗又為什麼要洗呢? 前者是從有detergent換到無detergent的環境應該要洗一下,後者都是用1% BSA in PBS反應,應該不用洗啦另外抗體之間洗的時間以我的經驗來講不太夠,我基本都是10min x 3次,二抗以後甚至會洗到10min x 5次, 你有沒有做Non-primary antibody control確認背景訊號? 判斷洗得夠不夠可以在二抗洗過幾輪以後去照螢光觀察訊號最後則是封片時有沒有吸乾封片液後再封指甲油? 這可能影響到片子的解析度喔回答得有點不通順請多包涵 : 以下圖檔: : 紅色：Mitotracker : 綠色：目標protein : 藍色：DAPI : http://i.imgur.com/zDygmBc.jpg

: 謝謝!!!!!!!! : ----- : Sent from JPTT on my Samsung SM-J700F. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.243.63.201 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1553279296.A.D0E.html ※ 編輯: joseph103331 (111.243.63.201), 03/23/2019 02:44:30 ※ 編輯: joseph103331 (111.243.63.201), 03/23/2019 02:45:48 ※ 編輯: joseph103331 (111.243.63.201), 03/23/2019 02:47:15