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[求救] Texas red phalloidin 已刪文

看板Biotech (生命科學)作者 (我還有點餓)時間5年前 (2019/07/02 02:10), 5年前編輯推噓13(13推 0噓 13→)
留言26則, 6人參與, 5年前最新討論串1/1
各位前輩晚安 想請問板上是否有前輩使用過這支染劑來染細胞骨架 試了好幾次都染不上去 我的濃度是1:40（in pbs) 室溫避光反應一個小時 但在螢光顯微鏡下都沒有任何螢光（連background 都沒有是正常的嗎？！） 且細胞在可見光下都碎裂了一堆渣渣 試過4%PFA+0.01%TritonX 也試過不fix不打洞 結果都是一樣的 不知道哪個環節出了問題 謝謝解答 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.136.69.15 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1562004659.A.13A.html ※ 編輯: couragechi (223.136.69.15 臺灣), 07/02/2019 02:16:30
推
07/02 16:51, 5年前 , 1F
個人沒有用過這支 顯微鏡的設定是對的厚
07/02 16:51, 1F
→
07/02 22:38, 5年前 , 2F
你有做過其他染色還是這是你第一次染色？細胞碎成渣渣
07/02 22:38, 2F
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07/02 22:38, 5年前 , 3F
的圖片可以貼上來看看？有沒有染DAPI可以看？
07/02 22:38, 3F
之前染癌細胞效果不錯，這次染foreskin結果就慘不忍睹
推
07/03 01:52, 5年前 , 4F
這隻應該1:500都蠻強的阿
07/03 01:52, 4F
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07/03 01:54, 5年前 , 5F
這隻是染 F-Actin, 並不能活染; 務必要 fix 後打洞染
07/03 01:54, 5F
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07/03 01:54, 5年前 , 6F
起來才漂亮
07/03 01:54, 6F
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07/03 01:55, 5年前 , 7F
你的 dye 本身還有顏色嗎?
07/03 01:55, 7F
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07/03 01:56, 5年前 , 8F
噢不 你要先讓你細胞留下來
07/03 01:56, 8F
我有no treatment組 UV組 UV+drug組 原本是覺得照了UV細胞比較脆弱所以PFA下去細胞碎光光好像滿有道理的。但是沒道理連c ontrol 都染不到也碎光光了～～開始處理動作 時在顯微鏡底下觀察過是有細胞的。開始處理動作一直到最後一步dapi後直接上顯微鏡就 都是渣渣 ※ 編輯: couragechi (223.136.69.15 臺灣), 07/03/2019 02:47:57 ※ 編輯: couragechi (223.136.69.15 臺灣), 07/03/2019 02:49:33
推
07/03 02:56, 5年前 , 9F
一步一步看啊 每一動完就看一下還有沒有細胞
07/03 02:56, 9F
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07/03 02:57, 5年前 , 10F
鐵口直斷triton濃度配錯XD
07/03 02:57, 10F
如果螢光染劑下了之後一直照可見光會不會decay很快？我怕會讓螢光效果不好所以開始 處理後就不上顯微鏡了 triton 的濃度有用0.1%跟0.01% 都只處理5分鐘而已 應該不會太 濃或是太久吧，不過不是新鮮現配的就是了(但染劑是從stock拿出來新鮮稀釋的） ※ 編輯: couragechi (223.136.69.15 臺灣), 07/03/2019 03:06:29
推
07/03 03:57, 5年前 , 11F
你現在是要debug 找細胞碎在哪裡 還不到成圖的階段
07/03 03:57, 11F
推
07/03 10:03, 5年前 , 12F
玻片有 coating嗎？ HFF 沒摳會長不好，後面隨便一沖
07/03 10:03, 12F
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07/03 10:03, 5年前 , 13F
就飄了
07/03 10:03, 13F
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07/03 10:05, 5年前 , 14F
Fixed cell 使用TX100 0.1% 1h以上應該都不會有問題
07/03 10:05, 14F
我們螢光顯微鏡可以直接放孔盤不用另外養玻片上 這次想直接先養到爆盤之後再來試試看 ※ 編輯: couragechi (223.136.69.15 臺灣), 07/03/2019 19:28:57
推
07/03 20:28, 5年前 , 15F
啊盤有摳嗎？
07/03 20:28, 15F
推
07/03 20:30, 5年前 , 16F
玻璃底還是一般 culture dish ? 這樣頂多拍20x 吧
07/03 20:30, 16F
一般的culture dish 而已，但之前拍40X沒問題 ※ 編輯: couragechi (223.136.69.15 臺灣), 07/03/2019 23:10:36
推
07/04 14:41, 5年前 , 17F
可能細胞fix的時候都飄走了,fix完用顯微鏡看看吧
07/04 14:41, 17F
來回報一下了～～ 0.1%Triton X 打3分鐘都碎成渣 完全做不了後續染色 ※ 編輯: couragechi (223.136.156.161 臺灣), 07/16/2019 00:26:40 ※ 編輯: couragechi (223.136.156.161 臺灣), 07/16/2019 00:27:21
推
07/18 10:43, 5年前 , 18F
Pfa用什麼東西泡？
07/18 10:43, 18F
推
07/18 10:47, 5年前 , 19F
Pfa我用PBS泡
07/18 10:47, 19F
推
07/18 14:55, 5年前 , 20F
你PFA 是不是壞了…
07/18 14:55, 20F
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07/18 23:36, 5年前 , 21F
同意樓上 pfa請愛用現配
07/18 23:36, 21F
推
07/19 00:46, 5年前 , 22F
看來是固定沒固定好欸
07/19 00:46, 22F
PFA跟triton X都是 in PBS. 雖然不是現配但有放冰箱保存請問也會壞很快嗎？超過兩個禮拜的就會再配新的 我是在想照過UV之後細胞本來就脆弱，所以固定跟打洞後細胞變成渣很正常？ 不過如果把培養液抽出來染浮在裡面的細胞是不是也染不到（覺得頭很痛QQ） ※ 編輯: couragechi (223.136.92.122 臺灣), 07/20/2019 03:46:01
推
07/20 07:38, 5年前 , 23F
如果 ctrl fix 完正常，照 UV 後 fix 完不妙 ，那有可
07/20 07:38, 23F
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07/20 07:38, 5年前 , 24F
能； 但我記得你說 ctrl 也會碎掉？
07/20 07:38, 24F
是的，我上面的回文有提過control也會碎 但那個問題目前排除了，因為學妹凍的那批細胞狀況不好，培養液有流沙形狀的污染。 我自己重養後control就沒問題囉 ※ 編輯: couragechi (223.136.92.122 臺灣), 07/20/2019 16:07:38
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07/22 02:56, 5年前 , 25F
重養後control沒事 uv會碎?
07/22 02:56, 25F
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07/22 02:57, 5年前 , 26F
uv是fixation的一種耶 理應變強壯
07/22 02:57, 26F
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