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[求救] western blot 小分子蛋白跑不出來

看板Biotech (生命科學)作者 (YY)時間5年前 (2019/11/26 17:07), 5年前編輯推噓12(12推 0噓 16→)
留言28則, 13人參與, 5年前最新討論串1/1
(手機排版亂掉抱歉QQ) 目標蛋白分子大小為17kDa, internal control 45kDa 下樣為25ug 上膠7.5% 下膠15% Running的時候120V 20min過上下膠交界線就改100V 2hr直到marker跑開接近1/5底板時停止 使用NCm，有接受別人建議先泡methanol結果爛掉(?)於是換新 Transfer(濕轉)條件有試過200mA/45min、200mA/1hr、300mA/90min、300mA/2hr Transfer的話除了200mA/1hr有完全的transfer過去，剩下的都會殘留在膠上，沒有染膠所 以確認方式就是看marker是否完全轉過 尤其200mA/45min的後續wash的時候連marker都會被洗掉近乎沒有 Actin都有跑出來也是對的位置 但目標蛋白的membrane，會看到一些band卡在裁切最上緣或最下緣，總之不是目標位置 想問是transfer的條件或是Running 的問題嗎？ 或是要改成PVDF嗎？ 謝謝大家！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.204.230.11 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1574759263.A.ED1.html
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11/26 18:02, 5年前 , 1F
有人建議你把NC跑methanol？
11/26 18:02, 1F
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11/26 18:23, 5年前 , 2F
NC泡methanol就融掉了阿 他說的是PVDF吧
11/26 18:23, 2F
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11/26 18:24, 5年前 , 3F
你要確認清楚啊
11/26 18:24, 3F
我有確認過，是說NCm泡沒錯，我也是泡了就溶掉QQ後來問說沾一下，但也是沾一下就爛掉 ※ 編輯: jpkiku0211 (180.204.230.11 臺灣), 11/26/2019 22:01:00
推
11/26 23:57, 5年前 , 4F
不管別人說什麼 請從單純NC或者是PVDF泡甲醇二選一
11/26 23:57, 4F
好的謝謝QQ
推
11/27 00:21, 5年前 , 5F
PVDF泡甲醇，wet transfer 180mA/3 hr
11/27 00:21, 5F
請問這樣不會有tran過頭的問題嗎？ ※ 編輯: jpkiku0211 (180.204.230.11 臺灣), 11/27/2019 00:44:23
推
11/27 04:27, 5年前 , 6F
若目標只有17/45，為何要做 step gel阿? 另，這個蛋
11/27 04:27, 6F
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11/27 04:27, 5年前 , 7F
白大小我大概 100V 55min 就好了
11/27 04:27, 7F
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11/27 04:29, 5年前 , 8F
我用 pvdf
11/27 04:29, 8F
可以請問一下什麼是為什麼要做step gel的意思嗎QQ
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11/27 09:04, 5年前 , 9F
用甲醇是要活化PVDF 使表面帶正電 可跟帶負電的protein
11/27 09:04, 9F
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11/27 09:04, 5年前 , 10F
target , NC膜大部分不用甲醇
11/27 09:04, 10F
但前輩真的寫NC泡methanol還做出來東西QQ
推
11/27 17:24, 5年前 , 11F
actin有跑出來應該是有轉好喔 你的條件也不像是會tran
11/27 17:24, 11F
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11/27 17:24, 5年前 , 12F
sfer過頭加上marker還在 鐵口直斷問題不是transfer
11/27 17:24, 12F
!!!但actin跑出來的band也是挺奇怪的就是，謝謝回答！！ ※ 編輯: jpkiku0211 (140.112.4.192 臺灣), 11/27/2019 20:35:02
推
11/27 22:18, 5年前 , 13F
哦我看懂了 我以為你下膠有兩種%數…沒事沒事
11/27 22:18, 13F
好的！
推
11/27 23:19, 5年前 , 14F
這大小還好 不過 有0.2um PVDF可以換用 NC不能碰甲醇
11/27 23:19, 14F
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11/27 23:20, 5年前 , 15F
然後 有actin的圖的話 可以放上來看 然後 電流可以開到400
11/27 23:20, 15F
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11/27 23:20, 5年前 , 16F
但是 可能要看看有沒有過熱 保冰效果如何
11/27 23:20, 16F
剛剛重跑了一次，這次換成0.22的PVDF膜了！transfer的話是buffer裡有放冰寶，外面放碎 冰，剛剛看是200多的marker沒有轉完全但下面的都有轉過去的樣子(100V/60min)
推
11/28 01:45, 5年前 , 17F
啊你講actin有跑出來位置也對 後來又講跑得很奇怪 又
11/28 01:45, 17F
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11/28 01:46, 5年前 , 18F
不放圖 是要版友讀心逆
11/28 01:46, 18F
不好意思QQ!!因為上次跑的後來才發現抗體好像有問題，所以位置對但band怪怪的，這次跑 換新買的抗體，想說看如何再放圖上來，不好意思也真的感謝大家的回答！ ※ 編輯: jpkiku0211 (49.219.133.17 臺灣), 11/28/2019 04:35:19
推
11/28 14:30, 5年前 , 19F
一般transfer buf 裡面就含有甲醇了，化掉是別的原因吧？
11/28 14:30, 19F
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11/28 17:09, 5年前 , 20F
buffer裡的甲醇濃度跟你直接碰純的甲醇不能比阿
11/28 17:09, 20F
推
11/28 20:37, 5年前 , 21F
nc可溶於甲醇 做得出來表示你前輩筆記太唬爛
11/28 20:37, 21F
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11/29 13:11, 5年前 , 22F
誰要給搞你，NC還泡 ...
11/29 13:11, 22F
謝謝大家的建議QQ今天看actin正確，只是深淺不一濃度可能要重測；而目標蛋白則是很一 致的落在15kDa 我可能要再去看paper想想這是怎麼回事 但至少小分子蛋白跑得出來了， 謝謝各位QQQQ ※ 編輯: jpkiku0211 (140.112.96.10 臺灣), 11/29/2019 16:39:42
推
11/29 17:11, 5年前 , 23F
跑個qRT確定有表現啊
11/29 17:11, 23F
有跑過ELISA確認過了～ ※ 編輯: jpkiku0211 (101.12.0.18 臺灣), 11/29/2019 21:06:44
推
12/02 17:59, 5年前 , 24F
請問原po後來是改什麼條件壓出來的呢？我最近也有一個9k
12/02 17:59, 24F
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12/02 17:59, 5年前 , 25F
Da的壓不出來～_～
12/02 17:59, 25F
推
12/12 00:17, 5年前 , 26F
17kDa,怎麼看都是Blotting的問題比較多
12/12 00:17, 26F
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12/12 00:18, 5年前 , 27F
0.45的PVDF或NC,17kDa跑不過去的啦
12/12 00:18, 27F
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02/13 16:14, 5年前 , 28F
比較常出現的問題都是0.22跟0.45的membrane亂用吧
02/13 16:14, 28F
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