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[求救] 蛋白質電泳問題

看板Biotech (生命科學)作者 (Nick)時間4年前 (2020/07/01 12:11), 4年前編輯推噓10(10推 0噓 21→)
留言31則, 10人參與, 4年前最新討論串1/1
小弟我construct了兩組clone，gene片段來自細菌，已經完成定序了，核對後序列無誤。 接著我把他transform到BL21(DE3)中表現protein做IPTG induction。 然後破菌去跑SDS page。 但問題來了，我跑出來的protein位置與我predict的位置不一樣 這組clone N端帶His，predict大概32 kDa(有加His的大小)，可是跑出來大概有50 kDa ，如圖https://imgur.com/dysBgBd
這是coomassie blue stain的結果 這是其中一組的data，另外一組clone也是一樣的問題，predict約98kDa， 但結果卻在110~120kDa左右。 煩請各位大大救我~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 61.216.25.217 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1593576711.A.DC5.html
推
07/01 15:09, 4年前 , 1F
每個Lane label一下，不然有點難幫忙
07/01 15:09, 1F
推
07/01 15:11, 4年前 , 2F
然後vector試用哪個？
07/01 15:11, 2F
→
07/01 15:12, 4年前 , 3F
*是
07/01 15:12, 3F
這是純化後跑SDS page的結果 這組vector是用pET28c 另一組則是用pGEX-4T1 https://i.imgur.com/RPkKJWx.jpg
推
07/01 15:29, 4年前 , 4F
predict不一定準，我純化His tag 蛋白也是差不多會
07/01 15:29, 4F
→
07/01 15:29, 4年前 , 5F
再比原來的蛋白+10 kda
07/01 15:29, 5F
不好意思～請問是為什麼呢？ ※ 編輯: len851002 (180.217.136.86 臺灣), 07/01/2020 16:13:07 ※ 編輯: len851002 (180.217.136.86 臺灣), 07/01/2020 16:14:10 ※ 編輯: len851002 (180.217.136.86 臺灣), 07/01/2020 16:15:17
→
07/01 18:50, 4年前 , 6F
07/01 18:50, 6F
→
07/01 18:52, 4年前 , 7F
可以看一下別人的討論，真的不放心就拿elution或bea
07/01 18:52, 7F
→
07/01 18:52, 4年前 , 8F
ds去跑WB壓蛋白本身的抗體或His的抗體看看是不是和c
07/01 18:52, 8F
好的 謝謝你 但還是不知道要怎麼用合理的理由跟老師解釋QQ
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07/01 18:52, 4年前 , 9F
ommassie的位置差不多就知道了
07/01 18:52, 9F
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07/01 21:06, 4年前 , 10F
要對map啦 很多vector的tag都不能只加tag的大小
07/01 21:06, 10F
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07/01 21:06, 4年前 , 11F
常常會順便帶一堆其他tag
07/01 21:06, 11F
我是對map後把片段translate然後去預測kDa的
→
07/01 23:13, 4年前 , 12F
但白質帶電量也會有影響，根據你SDS-PAGE的系統還會影
07/01 23:13, 12F
→
07/01 23:14, 4年前 , 13F
響marker跑的位置，marker終究只是參考
07/01 23:14, 13F
老師好像不太接受這個理由...我想說做到後面測bioactivity就能知道是不是我要的protein了.. ※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/01/2020 23:43:16 ※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/01/2020 23:44:31 ※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/01/2020 23:45:46
→
07/01 23:54, 4年前 , 14F
用WB確認tag，也有可能是dimer
07/01 23:54, 14F
我以為dimer的話會變成兩倍大
→
07/02 07:14, 4年前 , 15F
帶電太多的蛋白很容易差很多
07/02 07:14, 15F
有辦法知道他是否是帶電太多的蛋白嗎？
→
07/02 07:15, 4年前 , 16F
而且你要抓histag 還測activity 你加油
07/02 07:15, 16F
→
07/02 17:30, 4年前 , 17F
通常是post-translational modification造成的
07/02 17:30, 17F
應該不是 因為我送到BL21去expression
推
07/02 19:52, 4年前 , 18F
Ecoli作的protein一般不會有PTM
07/02 19:52, 18F
對的~謝謝 ※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/02/2020 21:15:47 ※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/02/2020 21:18:44 ※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/02/2020 21:20:54 ※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/02/2020 21:21:59
推
07/03 01:02, 4年前 , 19F
histag端 pI比一般polypeptide 高結合SDS效率會差一些
07/03 01:02, 19F
→
07/03 01:02, 4年前 , 20F
這會影響到net charge
07/03 01:02, 20F
推
07/05 13:43, 4年前 , 21F
是不是看一下induce前後的lyse 先確定那個位置是你ind
07/05 13:43, 21F
已確認過～確實是induce出來的
→
07/05 13:43, 4年前 , 22F
uce出來的
07/05 13:43, 22F
推
07/06 15:17, 4年前 , 23F
用28c的話，想請問一下你cloning進去的sequence有帶sto
07/06 15:17, 23F
有的～
→
07/06 15:17, 4年前 , 24F
p codon嗎？
07/06 15:17, 24F
推
07/07 06:02, 4年前 , 25F
你沒有non-induced control嗎？抓到的很有可能是渣
07/07 06:02, 25F
有做過control 與induce相比確實有差
→
07/07 06:03, 4年前 , 26F
序列丟protparam看一下pI >10就會慢很多
07/07 06:03, 26F
※ 編輯: len851002 (110.50.140.46 臺灣), 07/10/2020 22:03:47 ※ 編輯: len851002 (110.50.140.46 臺灣), 07/10/2020 22:04:44 ※ 編輯: len851002 (110.50.140.46 臺灣), 07/10/2020 22:04:59
推
07/15 15:47, 4年前 , 27F
切下來打個ms啊
07/15 15:47, 27F
最近要送了～ ※ 編輯: len851002 (1.200.202.113 臺灣), 07/16/2020 16:09:13
推
09/19 02:07, 4年前 , 28F
先送MS ID確認是否為你的蛋白~再送SEC MALS
09/19 02:07, 28F
→
09/19 02:08, 4年前 , 29F
而且如果蛋白的結構太flexible,page也會跑在不同的地方
09/19 02:08, 29F
→
09/19 02:09, 4年前 , 30F
雖然這種情況很少見,但我正在做的project就是如此
09/19 02:09, 30F
→
09/19 02:10, 4年前 , 31F
10kDa的蛋白~無論做什麼修改都是跑在40-50kDa之間!
09/19 02:10, 31F
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