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[求救] Transformation失敗

看板Biotech (生命科學)作者 (安德魯斯)時間3年前 (2021/09/08 00:38), 3年前編輯推噓24(24推 0噓 62→)
留言86則, 19人參與, 3年前最新討論串1/1
小弟是才疏學淺的專題生 最近要送一個Vector4.5k Insert3.6k的質體 酵素是NEB的KpnI-HF以及XhoI 根據NEB的Double Digests推薦的protocol 酵素切1ug的DNA 37度15分鐘 跑膠確定有切完 ligation的部分比例是3:1 4度overnight 送進Stbl3勝任細胞 ligation product 5ul跟10ul都有試過 加入後按照stbl3 protocol 冰上30min heat-shock 42度45sec 再冰上三分鐘 然後SOC 37度 recover 1hr 抗生素是用Kanamycin 塗盤卻只有一兩顆或是完全沒長 有一次check挑到一個clone有band 但是用Kna-LB養小量(20ul)一小時之後菌就消失了QQ 同儕也使用同一批勝任細胞送質體 長得很正常 請問各位大大ligation的部分還能怎麼改進嗎 如果有哪裡不對還請用力鞭 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.10.95.187 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1631032704.A.187.html ※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/08/2021 00:49:00 ※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/08/2021 01:23:14
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09/08 09:11, 3年前 , 1F
insert太長本來成功率就會低
09/08 09:11, 1F
我還有其他改善方法讓成功率更高嗎QQ
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09/08 09:31, 3年前 , 2F
猜同儕的質體或許不是用Kana
09/08 09:31, 2F
他的也是用Kna 而且我幫他transformation的 步驟完全一樣
推
09/08 12:19, 3年前 , 3F
ligation 3:1 是insert 3嗎
09/08 12:19, 3F
是Insert3:Vector1 有在想要不要把Insert提高 ※ 編輯: AndrewsLiu (60.251.229.159 臺灣), 09/08/2021 13:36:45 ※ 編輯: AndrewsLiu (60.251.229.159 臺灣), 09/08/2021 13:37:35
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09/08 14:36, 3年前 , 4F
比例可以試著調高至4：1至6：1,另外有試過insert用水
09/08 14:36, 4F
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09/08 14:36, 3年前 , 5F
回溶嗎？不用elution buffer
09/08 14:36, 5F
那我試試看把Insert比例提高 感覺有點高估Insert的DNA量 另外我Insert都是用55度ddH2O回溶的 ※ 編輯: AndrewsLiu (59.124.157.21 臺灣), 09/08/2021 15:02:11
推
09/08 19:30, 3年前 , 6F
可試試爆量insert DNA海戰術
09/08 19:30, 6F
這樣..真的可以嗎
推
09/08 20:02, 3年前 , 7F
你的比例是什麼東西的比例？
09/08 20:02, 7F
Vector ng/kb : Insert ng/kb 是1:3 ※ 編輯: AndrewsLiu (59.124.156.99 臺灣), 09/08/2021 22:21:42
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09/08 22:21, 3年前 , 8F
切過的DNA有跑膠後切膠純化嗎？5和10 uL是反應總體積還
09/08 22:21, 8F
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09/08 22:22, 3年前 , 9F
是用來transform的體積？Ligation反應每20 uL中有多少
09/08 22:22, 9F
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09/08 22:22, 3年前 , 10F
ng的DNA？
09/08 22:22, 10F
5ul跟10ul是用來transformation的ligation product的量 20ul裡面大概會抓100ng DNA InsertPCR後、Vector酵素切後都有切膠取 Insert的酵素切之後是直接clean up回收
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09/08 22:23, 3年前 , 11F
如果ligation的量夠多，可以拿vector、insert和ligatio
09/08 22:23, 11F
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09/08 22:24, 3年前 , 12F
n產物去跑膠，vector和insert應該是單一band，而ligati
09/08 22:24, 12F
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09/08 22:24, 3年前 , 13F
on產物則會有產生不同於vector和insert大小的band
09/08 22:24, 13F
前陣子實驗室安全染告急 有打算等安全染到了跑跑看！
推
09/09 00:05, 3年前 , 14F
推insert海 暗黑大法
09/09 00:05, 14F
有成功的經驗嗎 瞞著師試試看..? ※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/09/2021 00:34:31 ※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/09/2021 00:37:18
推
09/09 01:44, 3年前 , 15F
insert用t4 pnk處理看看
09/09 01:44, 15F
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09/09 01:46, 3年前 , 16F
喔看到用酵素切的 那就沒差了
09/09 01:46, 16F
推
09/09 12:51, 3年前 , 17F
聽你的描述，感覺可以做看看ligation positive cont
09/09 12:51, 17F
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09/09 12:51, 3年前 , 18F
rol
09/09 12:51, 18F
推
09/09 22:47, 3年前 , 19F
你加入ligation產物至勝任細胞混合是輕彈嗎？應該沒有
09/09 22:47, 19F
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09/09 22:47, 3年前 , 20F
pipetting吧？
09/09 22:47, 20F
沒有pipetting哦 都是flip的
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09/09 22:52, 3年前 , 21F
vector是用那一種？同儕用的跟你一樣嗎？
09/09 22:52, 21F
是一模一樣的vector
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09/09 22:53, 3年前 , 22F
要不要試著單純塞空載體進去看看能不能work
09/09 22:53, 22F
推
09/09 22:54, 3年前 , 23F
偏題想問一下 XhoI是rcutsmart buffer嗎？前陣子訂了XhoI
09/09 22:54, 23F
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09/09 22:54, 3年前 , 24F
& PstI，兩個的包裝說明都說可以只要反應5-15分鐘，但Ps
09/09 22:54, 24F
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09/09 22:54, 3年前 , 25F
tI給的buffer明明是舊款的3.1啊…
09/09 22:54, 25F
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09/09 23:02, 3年前 , 26F
default配什麼buffer官網都寫得很清楚
09/09 23:02, 26F
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09/09 23:07, 3年前 , 27F
NEB從buffer X變成X.1，現在又來rX.1,應該是想搞死自己
09/09 23:07, 27F
推
09/09 23:10, 3年前 , 28F
Rx.1如果不能直接對應123真的會搞死人...
09/09 23:10, 28F
還有 21 則推文
還有 2 段內文
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09/10 15:35, 3年前 , 50F
接insert進去的，但是養菌液也是幾個小時後就澄清然後
09/10 15:35, 50F
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09/10 15:36, 3年前 , 51F
長不出東西，後來除錯的結論是那段insert對細菌來說有
09/10 15:36, 51F
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09/10 15:37, 3年前 , 52F
毒，所以有接進去的都會長不好.....
09/10 15:37, 52F
其實現在做的是之前有完成的質體 只是定序之後發現綠螢光前面多兩個核甘酸 所以用 primer校正 所以insert應該是不會有太大問題的QQ
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09/10 16:02, 3年前 , 53F
我用50-100ng不只長太多,也增加挑到empty vector機率
09/10 16:02, 53F
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09/10 16:02, 3年前 , 54F
我們也用2,30ul買的台製勝任,10幾ng vector做ligation,取
09/10 16:02, 54F
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09/10 16:03, 3年前 , 55F
1/10去transform通常都長數十顆以上,不至於長不出來
09/10 16:03, 55F
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09/10 16:06, 3年前 , 56F
不過我們Amp plate只用40ug/ml可能算比較低的
09/10 16:06, 56F
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09/10 16:12, 3年前 , 57F
目前少到這樣的vector量,就能確保只挑一兩顆都會中
09/10 16:12, 57F
推
09/10 19:40, 3年前 , 58F
kanamycin濃度降到25ug/ml
09/10 19:40, 58F
Kna濃度降低會比較好嗎 小弟我資質愚笨 不懂原理QQ
推
09/10 19:48, 3年前 , 59F
B大, 我們也是台製細胞20ul左右；我其實試過amp 50ug/
09/10 19:48, 59F
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09/10 19:48, 3年前 , 60F
ml但發現長出來太多雜菌了 (可能我養太久了吧科科),後
09/10 19:48, 60F
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09/10 19:48, 3年前 , 61F
來就都用100了； 我一盤也是長大概10-20顆左右
09/10 19:48, 61F
推
09/10 20:16, 3年前 , 62F
我最近感覺塞太大的東西進去會影響copy number... 原
09/10 20:16, 62F
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09/10 20:16, 3年前 , 63F
本pUC19用100 塞了一個8k的東西進去後就只能50了
09/10 20:16, 63F
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09/10 20:24, 3年前 , 64F
我家的勝任細胞是自製的，分裝一管50 uL，我最多1管拿
09/10 20:24, 64F
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09/10 20:24, 3年前 , 65F
來做5個tranasform，也就是只用10 uL勝任細胞，Ligatio
09/10 20:24, 65F
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09/10 20:25, 3年前 , 66F
n產物加1~1.5 L，一般來說都會長幾百顆，vector contro
09/10 20:25, 66F
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09/10 20:25, 3年前 , 67F
l通常 <10 顆，所以命中率可以有90%以上
09/10 20:25, 67F
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09/10 20:26, 3年前 , 68F
Ligation產物加 1~1.5 uL......少寫個u
09/10 20:26, 68F
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09/10 23:45, 3年前 , 69F
買的勝任細胞不貴strain選擇也多,單管均價數十元,少挑2,3
09/10 23:45, 69F
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09/10 23:46, 3年前 , 70F
管mini或colonyPCR就能抵銷經費,畢竟命中率這麼高
09/10 23:46, 70F
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09/10 23:49, 3年前 , 71F
不過真是欽佩願意花時間自製又有這麼高的效率
09/10 23:49, 71F
※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/11/2021 00:06:27
推
09/11 08:59, 3年前 , 72F
kana半衰期沒那麼短吧？我們泡完兩三個禮拜都還堪用欸，
09/11 08:59, 72F
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09/11 08:59, 3年前 , 73F
濃度50 microgram/ml。倒是amp半衰期就很快，大概泡完超過
09/11 08:59, 73F
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09/11 08:59, 3年前 , 74F
三天我就當作他沒加過，用之前再塗上200 microgram/ml的量
09/11 08:59, 74F
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09/11 09:01, 3年前 , 75F
抗生素濃度太低的話，反而質體收不到刺激，複製效果會很差
09/11 09:01, 75F
推
09/11 11:48, 3年前 , 76F
在transformation時kanamycin降低濃度菌比較好長，後續li
09/11 11:48, 76F
→
09/11 11:48, 3年前 , 77F
quid culture會再提高到50 ug/ml
09/11 11:48, 77F
推
09/11 17:42, 3年前 , 78F
你怎不問Lab的前輩？
09/11 17:42, 78F
推
09/11 20:24, 3年前 , 79F
kana盤放三個月都還能用吧 amp我一個月就丟了
09/11 20:24, 79F
推
09/11 22:01, 3年前 , 80F
Kan超耐 幾乎都不用考慮雜菌問題! 只有兩個mer insert要去
09/11 22:01, 80F
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09/11 22:01, 3年前 , 81F
掉 改inframe 不考慮直接用site-direct 去掉?
09/11 22:01, 81F
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09/11 23:14, 3年前 , 82F
直接用site-direct kit最乾脆
09/11 23:14, 82F
推
09/13 15:03, 3年前 , 83F
Ligation 產物不要加超過competent cell體積的5%
09/13 15:03, 83F
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09/13 15:05, 3年前 , 84F
Ligation 試試16度 overnight, vector可以切多一點回溶體積
09/13 15:05, 84F
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09/13 15:06, 3年前 , 85F
小一點提高濃度, Kanamycin濃度降低會長出更多colony
09/13 15:06, 85F
推
09/14 14:48, 3年前 , 86F
好想知道你是誰
09/14 14:48, 86F
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