Re: [問題] 有關Real-time PCR 數據分析

看板BioMedInfo (生醫資訊)作者hajimels (阿一)時間10年前 (2014/11/28 00:24)推噓1(1推 0噓 1→)

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※ 引述《ophisoka (Hisoka)》之銘言： : 我現在手上有一種未知功能的蛋白質 : 已經有這個蛋白的 KO mice : 老闆要我取 wild-type and KO mice 不同器官的RNA跑RT-PCR : 比較相同器官中 WT and KO mice 這個蛋白基因的表現量 : 但跑完後我不清楚數據要如何分析 : 因為沒有一個 wt and KO 都可以用的標準值 : (我目前用的算法是把其中一個器官當1 但是KO也這樣算好像就不對了因基準點不一樣) : 有沒有什麼算法是可以取所有sample的絕對值(control是GAPDH) : 然後可以做出WT and KO 目標基因表達性差異的圖 : 還有我wt 已作3重複，要如何把3次統合起來 : ※ 編輯: ophisoka (140.123.186.178), 11/26/2014 16:47:30 很多人是用你要看的基因，跟GAPDH算出差值用Relatvie的概念去做Normalization 但我習慣以下方法： 1. 先把GAPDH在sample中的Ct值放在一起看是否差不多？一般來說Ct值不會差很多，除非你這個蛋白會直接影響到跟cytoskeleton相關的 pathways，若在確定不會影響，還差很多，那就手有問題，要重做..... 2. 利用全部samples的 GAPDH的平均值來算出每一個sample要調整多少值利如（由左到右分別3個WT, 3個KO GAPDH的Ct值): 15 14.5 15.5, 14.5 15.5 15 --> 平均15 scaling: 0 +.5 -.5, +.5 -.5 0 3. 你要看的基因就照這個scaling factor增減 4. 這樣子你就不用跟GAPDH去先做一個Relatvie的差值，同時也先檢查了你這次手穩不穩 5. 調整好後，把你要看的基因，在WT中的平均Ct值算出來得到 Mean.WT 把每個sample中的基因Ct值，都去減這個Mean.WT 你可以會得到 +.1 -.2 -.1, +8 +8.3 +7.8 這時候你就要用 2^-(上述數值) (為什麼要代負號知道吧？Ct越高表達量越低） Ratio: 0.933 1.149 1.072 0.004 0.003 0.004 最後若為3個biological replicate 就是畫 mean +- S.E.M, tech. replicate 為S.D 6. 在是biological replicates的情況下，可以再做T-test -- ★ミ ζ ○_. /(╯ 【今晚的天空有一顆流星劃過在預言著什麼】|> -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 165.100.176.27 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/BioMedInfo/M.1417105442.A.DF4.html