[問題] western blot band不均勻

看板Biology (生物學)作者 (平常心)時間15年前 (2010/09/02 20:24), 編輯推噓6(6014)
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【問題】:western blot 再running時,靠近marker的well都會斜一邊。 壓完片後,每個well的band不均勻 我是用0.75的膠 runnung 100v 1hr transfer 400A 1.5hr 全程on ice 【問題起因】:一開始以為是蛋白質定量的問題,一直再練習 現在定量都控制R^2 0.99。也有請學長幫我,照我定量 出來的配方,配sample。 但是,同一片膠,有我自己配的sample與學長配的sample 跑出來的band全部都不均勻,影像分析的結果當然是差異很大 (練習跑b actin) 【個人看法】:不太曉得是甚麼原因= =a 定量方面的R^2因該是沒問題 難道會是在loading 到well時出錯? sample我是跑膠前天準備好,冰再-20, 跑膠前退冰、votex直接loading <===會是這問題嗎? 麻煩大家幫我解決? 謝謝 這是我壓出來的圖 http://0rz.tw/naJ50 -- -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 120.126.71.89

09/02 23:50, , 1F
你做膠會不會有問題呀??
09/02 23:50, 1F

09/03 00:39, , 2F
會不會你在洗抗體的時候 是直接從中間出下去?
09/03 00:39, 2F

09/03 00:40, , 3F
這樣還滿容易把抗體沖起來的耶!?
09/03 00:40, 3F

09/03 01:04, , 4F
有圖嗎?
09/03 01:04, 4F
※ 編輯: eatofy 來自: 120.126.71.89 (09/05 23:03) ※ eatofy:轉錄至看板 Biotech 09/05 23:07

09/06 10:57, , 5F
每個well loading的"體積"是否一樣?
09/06 10:57, 5F

09/06 20:13, , 6F
我這次跑的 體積都調一樣 結果還是如此
09/06 20:13, 6F

09/06 20:40, , 7F
BioRAD的器材嗎?跑膠時,內外溶液都加到滿,跑慢一點+stir bar
09/06 20:40, 7F

09/06 22:54, , 8F
內外溶液都要加到滿很明顯就是錯誤的做法
09/06 22:54, 8F

09/07 21:48, , 9F
我是想可能因為內外溫差導致tailing, 這錯誤是錯在何處呢?
09/07 21:48, 9F

09/07 23:14, , 10F
Biorad,160V,>1h,30~50ug load,這是我的條件,可是沒那情況
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09/07 23:15, , 11F
何況我在室溫跑阿
09/07 23:15, 11F

09/07 23:17, , 12F
我不否定溫度可能影響結果,而是覺得溫度為果,真正且未知的
09/07 23:17, 12F

09/07 23:19, , 13F
"因"才是需要解決的; 就想很多人內層都會漏,所以內外buffer
09/07 23:19, 13F

09/07 23:20, , 14F
加一樣多就不會漏了,但是其實實驗不該是這樣解決的,不是嗎?
09/07 23:20, 14F

09/08 12:27, , 15F
我想這是實驗觀點不一樣吧, 不一定能算為錯誤. 比方我個人認
09/08 12:27, 15F

09/08 12:28, , 16F
為我們做是要問出與解決科學問題,而不是花時間解決漏buffer
09/08 12:28, 16F

09/08 12:29, , 17F
有時繞過問題也許可以更快找出答案. 當然不是說你觀點不對啦
09/08 12:29, 17F

09/08 12:30, , 18F
我猜想原po全程在ice上跑,內外溫差導致內外層擴散速率不同
09/08 12:30, 18F

09/08 12:31, , 19F
可能會導致tailing. Biorad與Owl跑膠設備都留stir bar空間
09/08 12:31, 19F

09/08 12:31, , 20F
為的也是希望溫度能在跑膠時更驅平衡不是嗎?
09/08 12:31, 20F
文章代碼(AID): #1CVvTXcN (Biology)
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