Re: [問題] 利用Fura-2 AM 測胞內鈣離子濃度
※ 引述《windwin (小均均)》之銘言：
: 【問題】：想用fluorescence spectrophotometer和Fura-2/AM 測鈣離子濃度，
: 是單純用ex:340 nm ，em:510 nm 測一次強度後，
: 再用ex:380 nm ，em:510 nm 再測一次強度。
: 因為需要得到 F(340/380)，所以將上述兩個強度數值相除就好了嗎?
: 還是別的技巧呢?
: 【問題起因】：
: 想側鈣離子濃度，我採用的細胞大多人使用fura 2測量，
: 但有很多測量方法，最後選用fluorescence spectrophotometer去測，
: 想知道自己有沒有想錯
: 最好是希望能找到有經驗的人可以問，
: 因為有一個老師跟我說其校正有難度，最好找有經驗的人幫忙
: 感恩
: 【個人看法】：
: 就是很單純先用340 nm測一次，再用380測一次，兩者強度相除。
: 【參考資料/連結】：
: The intracellular calcium concentration was determined by alternating
: excitation wavelengths of between 340 and 380 nm with emission at 510 nm,
: using a fluorescence spectrophotometer。(選自論文。)
F340/F380絕對不是鈣離子濃度。
CaFura2 = Ca + Fura2
F340 [Ca] F380
Kd=[Ca]*F380/F340, 所以 [Ca]=Kd*(F340/F380)
所以最少最少你都還要再去乘Kd(dissociation constant)，才有可能是鈣濃度。
但是事情沒那麼簡單，就像那個老師說的，校正有難度。
有一個calibration的公式，你可以去看invitrogen/molecular probe的網頁，都會寫這
個公式。
這個公式的重點有兩個，一個是飽和鈣離子螢光強度Fmax，和背景螢光值Fo
其中飽和鈣離子螢光強度非常的重要，因為每個Calcium indicator都有他們的極限，超
過極限這個indicator對於鈣離子濃度的敏感性就變差，而Kd值決定適當的感應濃度
範圍。像Fura2這個染劑，它的kd約在100nM左右，因此如果你的[Ca]超過200nM，Fura2就
已經對鈣離子的濃度改變幾乎不產生變化了。
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