Re: [問題] 利用Fura-2 AM 測胞內鈣離子濃度

看板Biology (生物學)作者HawkLiao (小健)時間13年前 (2012/07/25 22:36)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《Euronymous (Escape!!)》之銘言： : F340/F380絕對不是鈣離子濃度。 : CaFura2 = Ca + Fura2 : F340 [Ca] F380 : Kd=[Ca]*F380/F340, 所以 [Ca]=Kd*(F340/F380) : 所以最少最少你都還要再去乘Kd(dissociation constant)，才有可能是鈣濃度。 : 但是事情沒那麼簡單，就像那個老師說的，校正有難度。 : 有一個calibration的公式，你可以去看invitrogen/molecular probe的網頁，都會寫這 : 個公式。 : 這個公式的重點有兩個，一個是飽和鈣離子螢光強度Fmax，和背景螢光值Fo : 其中飽和鈣離子螢光強度非常的重要，因為每個Calcium indicator都有他們的極限，超 : 過極限這個indicator對於鈣離子濃度的敏感性就變差，而Kd值決定適當的感應濃度 : 範圍。像Fura2這個染劑，它的kd約在100nM左右，因此如果你的[Ca]超過200nM，Fura2就 : 已經對鈣離子的濃度改變幾乎不產生變化了。這回應有點問題 Ca.Fura2 = Ca + Fura2 Kd= [Ca][Fura2]/[Ca.Fura2] F340跟F380是沒辦法分別代表Ca.Fura2與Fura2的如果最原始的目的是要測量絕對的[Ca]，那會有相當麻煩校正的功夫如果只是要比較同一細胞[Ca]的改變，那可以用F340/F380的改變來代表改變的程度就看你希望表達的東西是什麼校正的重點應該是Rmax,Rmin,R=F340/F380 Rmax是幾乎全部fura2都與Ca結合時的螢光比值 Rmin則相反，全部Fura2都是Free form時的螢光比值其中有很多細節跟儀器操作上適用的問題讓有經驗的人來帶會快的多最後提到的[Ca]濃度太高基本上比較不會遇到，只要給的Fura-2夠多量到microM [Ca]都是可能的 data sheet上就有[Ca]從0到39.8 uM的excitation spectra 懷疑不夠準確的話，可以用low affinity的Fura-FF再量一次比較看看 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 219.80.238.185