Re: [問題] pET expression vector的選定

看板Biotech (生命科學)作者cloud74115 (阿亮)時間19年前 (2006/03/08 14:42)推噓6(6推 0噓 2→)

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空vector的有出來(GST 27 KD) fusion的沒有出來(fusion protein 87 KD) lysate的部份也有跑可是一樣都沒有出來(可是空的pGEX有GST出來) 另外我induction的環境是 2 mL菌液overnoght, 隔天1:20 total 2 mL refresh 養1~1.5小時, 0.1 mM IPTG 37度 3 hr 用50 uL B-per打破(有家protease inhibitors) 並且幾乎都是一天做到comassive染色後來甚至還用GST抗體去抓(我的protein目前還沒有看到有賣抗體) 跑Western(有用空pGEX做control) 可是還是一樣沒有看到所以才會打算要換系統是看看目前是看中pET系統的 pET28a+ 可是舊的pGEX還是會繼續screen 不知道各位有沒有什麼好建議 PS : 最近快做到瘋掉了甚至有人說有沒有可能是分泌出來啦但是我想這個應該不大可能吧麻煩各位摟 ※ 引述《liger.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (還要在努力~~~)》之銘言： : ※ 引述《cloud74115.bbs@ptt.cc (阿亮)》之銘言： : > 之前將我的insert接到pGEX4T1這個vector : > 定完序列也送到BL21作表現蛋白質 : > 同時也有做空pGEX4T1做control : > 可是做了很久 : > 一直沒有看到我的fusion protein有被表現出來 : > 但是空的pGEX4T1卻明顯有出來 : > 和老師討論過後老師也不知道為什麼會這樣 : > 所以後來決定要換套系統是看看 : > 現在想要看pET哪個vector最適合 : > 將insert這個protein純化出來後 : > 目的要做in vitro binding assay : > 另外我的蛋白質是膜蛋白 : > 大概是1.6 bp : 有induction出來嗎 : 有的話大概是因為不溶的關係吧變成inclusion body了 : 如果induction不出來的話 : 可以試試看induction 時間加長 (at low temp, and low IPTG) : Otherwise, you can just try another system, such as MBP, his-tag, : or other new system like "Impact" (from invitrogen??). : Good luck. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.15.174.98