[問題] RNAlater
想要請問抽RNA的先進
請問細胞收下來之後 要馬上就抽RNA 或是有什麼辦法能保存?
因為有時候要收時間點 想要全部收完再一次抽RNA 轉cDNA
加RNAlater冰 4度C http://www.ambion.com/techlib/prot/bp_7020.pdf ?
或是加了Trizol之後 冰-80!?
再加Trizol之前 我細胞是要先加入少量PBS(一般細胞用 無RNase-free)打散
還是可以先離心呈pellet狀後 去上清 再加入Trizol打散
怎麼樣做比較好!?
那抽完RNA轉成cDNA後
要如何去訂cDNA濃度 測OD!?
因為一直抽不好
我抽完RNA 測OD 260/280都有1.8以上
然後跑膠
(沒有用特定的RNA gel, 只是用1% agar gel, 100mV, 8mins, 糊掉,
沒有18S.28S分明的band)
但還是硬著頭皮坐下去 取1ug的RNA 加DNase 然後再RT轉成cDNA
轉完測OD 值都差不多 1ug~1.5ug (但裡面含有enzyme buffer...這個值不可信吧!?)
然後PCR 使用GAPDH primer(約200bp) 35cycle 都有出來
但P我自己基因的一般PCR primer(約500bp) 有的有 有的沒有(應該是要P到的)
有加positive control 是OK的
我主要的目的是要做real time PCR
但在抽RNA品質那麼不一糟糕的狀況下 實在不知道data.........@@
所以想要請問先進們的經驗
或是有什麼資料我可以去閱讀的 麻煩大家指點 謝謝 :>
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