Re: [問題] RNAlater
※ 引述《hita (JIN)》之銘言：
: 想要請問抽RNA的先進
: 請問細胞收下來之後 要馬上就抽RNA 或是有什麼辦法能保存?
: 因為有時候要收時間點 想要全部收完再一次抽RNA 轉cDNA
: 加RNAlater冰 4度C http://www.ambion.com/techlib/prot/bp_7020.pdf ?
: 或是加了Trizol之後 冰-80!?
加Trizol裂細胞之後，-80度可以保存幾周沒問題
: 再加Trizol之前 我細胞是要先加入少量PBS(一般細胞用 無RNase-free)打散
: 還是可以先離心呈pellet狀後 去上清 再加入Trizol打散
: 怎麼樣做比較好!?
應該沒需要吧
我都是
把培養基吸掉，PBS洗一下，棄去
然後直接把Trizol加到培養皿裡
莫非你抽的是懸浮細胞？
: 那抽完RNA轉成cDNA後
: 要如何去訂cDNA濃度 測OD!?
沒法的啦，定量是在做RT之前
: 因為一直抽不好
: 我抽完RNA 測OD 260/280都有1.8以上
基本正常阿
和你用的溶解RNA的水有關系
小于1.65才不對
: 然後跑膠
: (沒有用特定的RNA gel, 只是用1% agar gel, 100mV, 8mins, 糊掉,
: 沒有18S.28S分明的band)
其實不需要RNase free的膠，把電泳槽洗洗幹凈，換新的電泳液就可以了
除非你剛跑過大抽質粒的電泳，那會帶入很多RNase
（我師妹就幹過這種事，抽出RNA跑電泳看，說全降解了，我看了一眼，槽很臟，
而且竟然用的回收重融的膠，新配一塊再跑一次就OK了）
我一般都用100V，跑15-20min，你的電壓不會太小？時間不會太短？
另外，5S有看到嗎？
如果是都降解掉了，5S那會一大陀
: 但還是硬著頭皮坐下去 取1ug的RNA 加DNase 然後再RT轉成cDNA
: 轉完測OD 值都差不多 1ug~1.5ug (但裡面含有enzyme buffer...這個值不可信吧!?)
好像這一步沒人測OD的吧
: 然後PCR 使用GAPDH primer(約200bp) 35cycle 都有出來
GAPDH應該很容易拉出來才對，頂多25循環就飽和了，35cycle應該暴掉了
: 但P我自己基因的一般PCR primer(約500bp) 有的有 有的沒有(應該是要P到的)
: 有加positive control 是OK的
: 我主要的目的是要做real time PCR
: 但在抽RNA品質那麼不一糟糕的狀況下 實在不知道data.........@@
: 所以想要請問先進們的經驗
: 或是有什麼資料我可以去閱讀的 麻煩大家指點 謝謝 :>
如果有問題還是抽RNA的時候吧
仔細再看看Trizol的說明書
抽RNA的時候都要用RNase free的或是DEPC處理過的試劑、槍頭
另外一直要帶手套和口罩，手是RNase最大來源
還有不要用vortex，那樣打斷長的轉錄本
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