Re: [問題] 剪切活性問題
看板Biotech (生命科學)作者linzhengzhan (研究所：碩士班vs博士班)時間19年前 (2006/05/24 11:35)推噓0(0推 0噓 0→)留言0則, 0人參與討論串2/2 (看更多)
※ 引述《rudyrudy (我愛梁朝偉)》之銘言：
: 不好意思 問一個小問題 麻煩大家了
: 假設pGLO長5.4kb，lambda DNA長48.6kb，由下列減量測試數據，推算HindⅢ活性。
: (50-80%)
: a. 測試之pGLO之總量為1μg。
: b. 37°C切1小時，最佳Buffer配方
: c. HindⅢ原濃度為10 u/μl，使用量為1μl。
: d. 2X稀釋可完全剪切，但3X稀釋則開始有未切片段。
: 謝謝謝謝
NEB 對HindIII的unit definition為
１U 的HindIII，對１ug的λ-DNA可以切的完全，在37℃，反應體積遵為50ul。
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
請參閱enzyme manual。
而λ-DNA上有7個HindIII的切點。 ref：NEB 2005.06 catalog p.293
1bp的average M.W.為650 Da
所以，要將之轉到莫耳數 (mole, 這才是真正的分子數量)，再數到unit上
=> λ-DNA：48,502bp
10^-6 10^-6
----------- * 7： 1 = ------------ * 1： X
48502*650 5,400*650
解釋：
10^-6的λ-DNA被切7刀，為一個unit；依比例而言，10^-6次的pGLO DNA (假設只切一刀)
需 X unit(s)。
就可以算出最適量的unit，再視情況，調整到所需要的倍數。
至於enzyme reaction buffer，請參閱NEB 2005.06 catalog 或是 其他廠商的catalog
ps. HindIII (NEB) reaction buffer 為 NEB buffer 2。
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