Re: [問題]cell要染PI跑cytoflow可以用PFA固定嗎？

看板Biotech (生命科學)作者biolenz (冷次)時間19年前 (2006/05/25 02:32)推噓1(1推 0噓 0→)

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我看到你的問題直覺反應覺得應該從兩方面來改善。第一，固定的方法。第二，GFP 的挑選。為了驗證我的想法，我查 google 的結果，給你做個參考。關鍵字：GFP、ethanol 一、固定的方法部份這裡有相關的解決辦法，是從固定的方法著手。 http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/1997/0536.htm 摘要如下： Cells were fixed in 0.25% paraformaldehyde for 5 minutes Wash in PBS Fix in cold 70% Ethanol for 30 minutes Wash in PBS x3 RNase (100ug/ml, 10 mins RT), then 50ug/ml PI 二、GFP 的挑選部份另外有一個網頁是講從 GFP 本身著手，原本網頁已經失連，google 有存檔，如下： Simultaneous Analysis of GFP and CELL CYCLE http://0rz.net/a31o8 內文提到可以使用 transmembrane 的 GFP 可以改善在 PI 染色下 GFP 被酒精破壞的現象。相關論文如以下兩篇： Kalejta RF, Shenk T and Beavis AJ. (1997) Use of a Membrane-Localized Green Fluorescent Protein Allows Simultaneous Analysis of Transfected Cells and Cell Cycle Analysis by Flow Cytometry. Cytometry, 29:286-291. Kalejta RF, Brideau AD, Banfield BW and Beavis AJ. (1999) An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry. Exp. Cell Res. 248:322-328. 實際商品部分可能要自己去問問看。 ※ 引述《stonegirl (Girls, be ambitious)》之銘言： : 我的細胞會表現EGFP 因為我染PI(propidium iodide)想要看cell cycle : 希望看得是有表現EGFP的細胞 : 我原本是照PI的protocol利用EtOH固定結果跑flow時完全偵測不到EGFP : 跟學長討論的結論是可能酒精會影響EGFP表現 : 想問問各位前輩們我要做PI染色可以用paraformaldehyde固定嗎？此段回答如上。 : 另外我想再問關於flow的問題 : 我們學校那台flow共有三個濾片 FL1 FL2 FL3 : 看EGFP是用FL1 我查了一下emission在508nm : 看PI 用FL3 PI emission在620nm 但是PI + DNA 約在514nm : 那這兩個會不會影響到呢？需不需要做互補？ : 很多問題.......麻煩大家了關於濾鏡的問題，我想你是在說 sideward scatter 的部份。這牽涉到你們家的 flow 其濾鏡的規格，如濾過的波長是多少是 LP (long pass) 還是 BP (band pass) 之類的問題。我想你自己會比我們還清楚一些。在此推薦一個網站，濾片的原理與選擇，molecular probe 做得相當好。 (現在為 invitrogen 子公司) 以下為簡要說明與連結：螢光原理教學 flash 分別有螢光原理簡介、光譜與光源和濾鏡三個部份。 http://probes.invitrogen.com/resources/education/ 另外一個 Fluorescence Spectraviewer 有提供目前實驗上常用到的染劑的激發光與放射光波長與波峰圖形的資料。不同種類染劑在不同濾鏡組合之下 overlap 的問題很容易可以看得出來。 http://probes.invitrogen.com/resources/spectraviewer/ 希望有幫得上忙 :) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.127.160.142 ※ 編輯: biolenz 來自: 140.127.160.142 (05/25 03:01)