Re: [問題]cell要染PI跑cytoflow可以用PFA固定嗎？

看板Biotech (生命科學)作者everblue.時間19年前 (2006/05/25 14:27)推噓0(0推 0噓 3→)

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※ 引述《stonegirl.bbs@ptt.cc (Girls, be ambitious)》之銘言： : 我的細胞會表現EGFP 因為我染PI(propidium iodide)想要看cell cycle : 希望看得是有表現EGFP的細胞 : 我原本是照PI的protocol利用EtOH固定結果跑flow時完全偵測不到EGFP : 跟學長討論的結論是可能酒精會影響EGFP表現 : 想問問各位前輩們我要做PI染色可以用paraformaldehyde固定嗎？ EGFP expression通常在細胞被固定之後就看不到了如果你的GFP在被PFA固定後還可以被偵測到那你倒可以試試 PI staining本身只要細胞被permeablize PI可以進入細胞核染到DNA 我想如何固定細胞應該不是最大的問題我的建議是用EGFP antibody做intracellular staining 至於如何將PI staining和intracellular staining結合在一起最常被使用的範例就是 anti-BrdU和PI的例子我稍微google了protocol (可以看看他們如何固定細胞) 貼一個範例給你參考 http://www.cancer.wisc.edu/clinician/flow/protocol-brdpi.html : 另外我想再問關於flow的問題 : 我們學校那台flow共有三個濾片 FL1 FL2 FL3 : 看EGFP是用FL1 我查了一下emission在508nm : 看PI 用FL3 PI emission在620nm 但是PI + DNA 約在514nm : 那這兩個會不會影響到呢？需不需要做互補？ : 很多問題.......麻煩大家了 PI可以被FL2 and FL3 detected somehow 也會影響FL1 (反之亦然) 但是請注意 EGFP/antiboy螢光的測定是Log mode PI的測定則是用linear mode 需要注意的是FL2 channel(linear mode) 偵測到的FL1 (log mode) 確定FL1不會干擾你cell cycle的判讀你可以做以下control 1. mouse spleenocytes with PI staining only 這是很好的cell cycle profile control 因為spleenocyte每一個stage的細胞都有 2. FITC/GFP only-> gate FITC/GFP+ cells-> display at FL2-A (linear mode) 看看peak 會出現在哪裡應該不會干擾到才是 -- 如果我是你我會想辦法sort EGFP+ and EGFP- cells 之後再固定起來看PI -- ※ 發信站: 批踢踢參(ptt3.cc) ◆ From: 70.120.180.194