Re: [問題] 蛋白質表現相關問題~~

看板Biotech (生命科學)作者threestars (等待)時間19年前 (2006/07/01 01:32)推噓2(2推 0噓 0→)

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※ 引述《realm.bbs@ptt3.cc (realm)》之銘言： : 這是我第一次做蛋白質表現... : 我的是帶有his-tag的蛋白質...於E. coli中表現... : 用Ni-NTA進行純化... : 目前的問題是...我懷疑是因為表現量太高...所以我的蛋白在pellet的部分... : 就我所知, 透過調整培養條件等等...可以將pellet的蛋白變成在supernatant中... : 我之前的條件...37度, 0.5 mM IPTG, 6小時 : 我在想...將溫度改成30度...減少IPTG的量...不過不知道該減少到多少... : induction的時間是否需要調整... : 因此想請教有相關經驗的大大~~能否提供一些經驗分享~~ : ...另外想問我的觀念是否正確... : 之所以可以將pellet中的蛋白變到supernatant中... : 主要是因為透過培養條件的調整, 使蛋白的表現量下降... : 這樣的觀念對嗎?? : 先謝過~~:) 說表現量太高也不完全錯可以說是短時間內蛋白質表現量過大形成inclusion Body 降低溫度也是一個手段可以用30 25 20度去試試看但是形成inclusion Body 不一定只是溫度太高的問題第一個比較糟糕的可能是你的蛋白質序列可能有突變而無法的形成正常結構導致是以peptide形式出來如果量又多容易形成Inclusion Body 如果你用低溫（20度）induction 還是一樣的話就要小心了第二個比較樂觀的可能是你用的菌株如果是BL21 因為他細胞質環境處於還原狀態（E.coli都是）所以雙硫鍵無法形成容易使出來的protein處在peptide形式可以用origami (<-不知有沒有拼對) 這個E.coli不會破壞雙硫鍵但表現量感覺比BL21差（這只是感覺我沒做比較）基本上induction的條件要慢慢去抓當然如果之前有人純化過這種蛋白有條件的話會比較輕鬆祝好運～～ -- 如果活在世上只是扮演著大家所期望的自己那扮演好了又怎樣不如靜靜的讓自己消失吧總是多餘的存在只是種荒謬的錯誤 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.15.174.141